【摘要】：黃連是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一,是毛茛科植物黃連、三角葉黃連、云南黃連的干燥根莖。黃連性寒,味苦,具有清熱燥濕,瀉火解毒的功效,具有歷史悠久,來源和藥用價(jià)值廣泛的特點(diǎn)。近年來,隨著中醫(yī)藥與醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,黃連越來越多的藥理作用被展示出來了。研究證明,黃連具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、抗血小板聚集和改善心腦血管疾病等藥理活性。黃連含多種異喹啉類生物堿,主要由小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、非洲防己堿和藥根堿組成,其中小檗堿含量最多。目前,小檗堿作為廣泛的研究對象,已有許多藥理功效被發(fā)現(xiàn),但其他生物堿還需要深入研究,而黃連堿和小檗堿有相同的母體結(jié)構(gòu),且兩者結(jié)構(gòu)差異小。肝細(xì)胞癌是世界上最常見和最具有侵襲性的惡性腫瘤之一,而其分子發(fā)生機(jī)制尚不明確。許多研究表明miR-122是一種肝特異性microRNA,占約肝臟總microRNA的70%,是一種抑癌基因,通常在肝癌中表達(dá)下調(diào)。因此,本研究建立荷人肝癌細(xì)胞株HepG2的BALB/c雄性裸鼠移植瘤模型,初步研究黃連堿的抗肝癌活性及其作用機(jī)制;并研究了黃連堿對內(nèi)毒素和D-氨基半乳糖造成的急性肝損傷的肝預(yù)防保護(hù)作用。本研究的內(nèi)容和結(jié)構(gòu)如下:⑴黃連堿安全性。對處于對數(shù)期生長狀況良好的HepG2、Huh7和L02細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),檢測不同濃度的黃連堿對細(xì)胞毒性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連堿具有選擇性誘導(dǎo)HepG2、Huh7細(xì)胞凋亡而對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒性。當(dāng)藥物濃度達(dá)到25μg/mL時(shí),HepG2和Huh7細(xì)胞成活率低于80%,但對L02細(xì)胞沒有明顯毒性,但當(dāng)藥物濃度達(dá)到300μg/mL時(shí),L02細(xì)胞的成活率低于80%。所以,黃連堿是一種低毒的安全化合物且具有肝保護(hù)作用。HepG2、Huh7和L02細(xì)胞IC_(50)值分別為47.056μg/mL、61.831μg/mL和329.265μg/mL。⑵黃連堿抗肝癌活性體外實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,主要檢測黃連堿對HepG2和Huh7細(xì)胞增殖能力、遷徙能力的抑制,對凋亡和miR-122表達(dá)的影響。分別通過MTT法和集落形成實(shí)驗(yàn),劃痕愈合實(shí)驗(yàn),Hoechst 33258和流式細(xì)胞術(shù),RT-qPCR檢測相關(guān)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞24h的黃連堿IC_(50)值為47.056μg/mL,Huh7細(xì)胞的黃連堿IC_(50)值為61.831μg/mL,黃連堿對HepG2的增殖抑制效果更強(qiáng);并且,25μg/mL濃度的黃連堿在7d后完全抑制HepG2細(xì)胞的增殖并且致全部細(xì)胞死亡。25μg/mL的黃連堿有效的抑制HepG2、Huh7細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-122模擬物的HepG2細(xì)胞的遷移。黃連堿可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。⑶黃連堿抗肝癌活性體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將處于對數(shù)生長期且具有95%存活率的人HepG2細(xì)胞,皮下接瘤于4周齡的BALB/c雄性裸鼠的右肩胛部位。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性藥物組(索拉菲尼,120.13mg/kg)以及黃連堿高劑量組(150mg/kg)。接種后裸鼠隨機(jī)分組,每組8只,裸鼠的腫瘤體積每5天測量一次,為期30天。索拉菲尼和黃連堿溶于超純水,藥物組成瘤后每只每日一次按體重進(jìn)行成灌胃,模型組灌等體積的生理鹽水。通過HE染色分析裸鼠肝臟和腫瘤的組織病理學(xué)變化,Western blot和RT-qPCR分別檢測肝臟和腫瘤的相關(guān)蛋白的表達(dá)變化、miR-122表達(dá)水平的變化,并且監(jiān)測裸鼠的腫瘤體積的變化,體重變化,肝、腎、脾與體重重量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組相比,黃連堿組與索拉菲尼組均能抑制腫瘤的生長(P0.01)并且兩者之間差異沒有達(dá)到顯著性。黃連堿提高了裸鼠肝臟miR-122的表達(dá)水平。無論從肉眼直接觀察還是從HE染色結(jié)果,均顯示了黃連堿有保護(hù)肝臟的效果;臟體比進(jìn)一步展示出黃連堿的低毒害功效。⑷黃連堿肝保護(hù)作用體外實(shí)驗(yàn):通過MTT法篩選出合適的內(nèi)毒素(LPS)濃度、黃連堿濃度以及兩者共作用的濃度在HepG2、L02細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以及建立肝損傷細(xì)胞模型。以及觀測內(nèi)毒素和黃連堿對HepG2、L02細(xì)胞72h生存率的影響。并通過PT-qPCR檢測了miR-122的變化。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了轉(zhuǎn)染miR-122模擬物和miR-122抑制物及其相關(guān)對照物后的HepG2、L02細(xì)胞的凋亡率的變化。用蛋白免疫印跡法檢測HepG2、L02細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)內(nèi)毒素達(dá)到10μg/mL即可建立細(xì)胞的肝損傷模型。黃連堿對肝細(xì)胞具有選擇性的保護(hù)作用,對HepG2細(xì)胞毒性大,但對L02細(xì)胞毒性小。黃連堿使HepG2細(xì)胞miR-122的表達(dá)下調(diào),使L02細(xì)胞miR-122的表達(dá)上調(diào)。黃連堿促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡,相反,通過抑制凋亡來保護(hù)L02細(xì)胞。⑸黃連堿肝保護(hù)作用體內(nèi)實(shí)驗(yàn):4周齡的雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白對照組,模型組,黃連堿低劑量組(37.5mg/kg),黃連堿高劑量組(150mg/kg),每組10只小鼠。藥物組進(jìn)行每只每日一次進(jìn)行灌胃,連續(xù)7天,最后一次灌胃1h后用內(nèi)毒素(500ug/kg)/D氨基半乳糖(400mg/kg)混合液進(jìn)行腹腔注射誘導(dǎo)急性肝損傷模型。檢測血清的AST、ALT,肝組織勻漿的GSH、SOD變化。RT-qPCR檢測肝組織的miR-122變化。HE染色分析肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,免疫組化分析相關(guān)凋亡蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,內(nèi)毒素和D氨基半乳糖導(dǎo)致了肝臟的凋亡,但黃連堿有著上調(diào)GSH、SOD、miR-122和下調(diào)AST、ALT的能力,黃連堿在急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中有預(yù)防保護(hù)作用�？傊�,通過上述實(shí)驗(yàn),表明黃連堿對肝癌細(xì)胞有抑制增殖、遷移和促進(jìn)凋亡的作用,并且在裸鼠中通過上調(diào)miR-122來抑制腫瘤的生長和在急性肝損傷中保護(hù)肝臟作用。
【圖文】：

第 3 章 黃連堿的安全性評價(jià)選擇性誘導(dǎo) HepG2、Huh7 細(xì)胞凋亡而對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒性。當(dāng)藥物濃度達(dá)到 25 μg，HepG2 和 Huh7 細(xì)胞成活率低于 80%，但對 L02 細(xì)胞沒有明顯毒性（圖 3-1），物濃度達(dá)到 300 μg/mL（圖 3-2）時(shí)，L02 細(xì)胞的成活率低于 80%。所以，黃連堿是毒的安全化合物且具有肝保護(hù)作用。HepG2、Huh7 和 L02 細(xì)胞 IC50值分別為 47/mL、61.831μg/mL 和 329.265μg/mL。

圖 3-2 黃連堿對 L02 細(xì)胞存活率的影響Figure3-2 Effects of Coptisine on L02 cellsviability cells treated with COP at concentrations range from 0 to 500 μg/mL for 24h. The data were shown asD with relative optical density values at 490 nm or counted using a hemocytometer in three dueriments. (*p < 0.05 and**p < 0.01 vs controlgroup).5 討論與小結(jié)植物提取物通常因?yàn)橛兄⑿〉母弊饔枚徽J(rèn)為是安全無害的[87]。臨床上黃連常不良反應(yīng)主要集中在消化系統(tǒng)（如腹瀉），常規(guī)應(yīng)用黃連飲片而引起不良反應(yīng)的情，，不良反應(yīng)常與個(gè)體的體制，既往病史，過敏史，服用藥物的劑量與方式等因素有黃連注射液可引起過敏性休克，黃連忌與菊花等性寒之物配伍，脾胃虛弱的人也不連，黃連也不得長時(shí)間服用[88,89]。本研究中，細(xì)胞的安全用量通過 MTT 法來選擇
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2641240