【摘要】：中草藥南蛇藤,衛(wèi)矛科南蛇藤屬,藥性辛溫,有小毒,具有祛風、活血、解毒、消腫等功能。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),南蛇藤提取物(CelastrusOrbiculatus extracts,COE)具有較強的抗腫瘤活性,能抑制腫瘤細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡,但其分子機制還未完全明確。原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),消化道最常見的惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病率呈上升趨勢,致死率在所有癌癥中居第三位。目前采取以手術切除為主的綜合治療模式,但是愈后不佳。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)參與多種生理與病理過程,是細胞內(nèi)許多重要信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵樞紐,其功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關。為了研究南蛇藤提取物是否靶向mTOR發(fā)揮抗腫瘤活性,本文構(gòu)建了過表達mTOR基因的人肝癌HepG2細胞株(記作HepG2/mTOR+細胞),加入不同濃度的南蛇藤提取物干預后,探討COE對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響及機制。結(jié)果顯示,與對照組相比,在一定濃度范圍內(nèi),COE呈濃度依賴性地減少mTOR的表達,抑制人肝癌HepG2細胞的增殖,促進人肝癌HepG2細胞凋亡,其分子機制可能與南蛇藤提取物抑制mTOR相關信號轉(zhuǎn)導通路有關。本研究內(nèi)容共分四部分。第一部分人肝癌HepG2/mTOR+細胞株的構(gòu)建目的:構(gòu)建過表達mTOR蛋白的人肝癌HepG2細胞株。方法:體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞株至對數(shù)期,利用分子生物學技術,將GV238-mTOR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細胞中,同時設陰性對照組和野生細胞對照組。24h后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。收集細胞總蛋白,Western blot法檢測人肝癌HepG2細胞中mTOR蛋白的表達量。結(jié)果:轉(zhuǎn)染24 h后,倒置顯微鏡下觀察,野生型細胞貼壁生長,呈梭形,細胞輪廓清晰,細胞壁光滑無突起,折光性良好,核質(zhì)均勻。與之相比,大部分HepG2/mTOR+細胞形態(tài)無顯著變化,少量細胞變圓。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,HepG2/mTOR+細胞中mTOR蛋白的表達水平顯著增加。結(jié)論:成功構(gòu)建了人肝癌HepG2/mTOR+細胞株。第二部分南蛇藤提取物對人肝癌HepG2/mTOR+細胞的影響目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)對人肝癌HepG2/mTOR+細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2/mTOR+細胞,加入不同濃度的COE(20,40,80,160,320 mg/L),以野生型細胞為陰性對照,2mg/LDDP為陽性對照。MTT法檢測各組藥物對人肝癌HepG2/mTOR+細胞增殖能力的影響;倒置顯微鏡及透射電鏡觀察形態(tài)學改變;流式細胞術檢測藥物對人肝癌HepG2/mTOR+細胞凋亡的影響;細胞劃痕法檢測藥物對人肝癌HepG2/mTOR+細胞爬行能力的影響;Transwell實驗研究細胞侵襲遷移的變化。結(jié)果:與野生型細胞相比,HepG2/mTOR+細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯增強。與未加藥組相比,在一定濃度范圍內(nèi),COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR+細胞的增殖、侵襲及遷移,促進其凋亡,并呈明顯的濃度依賴性。結(jié)論:mTOR的表達水平與腫瘤細胞的惡性行為相關。COE能降低mTOR的表達水平,抑制人肝癌HepG2細胞的增殖、侵襲及遷移,并促進腫瘤細胞凋亡。第三部分南蛇藤提取物促進人肝癌HepG2/mTOR+凋亡的分子機制目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)對人肝癌HepG2/mTOR+細胞mTOR信號通路及凋亡相關蛋白表達水平的影響,初步探討其分子機制。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2/mTOR+細胞,為了避免細胞毒性作用的干擾,根據(jù)IC50的結(jié)果,加入不同濃度COE(20,40,80mg/L),同時設立野生細胞對照組和陽性藥物對照組(2 mg/L DDP)。作用24 h后,Western blot法檢測各組目的蛋白的表達水平。結(jié)果:COE抑制人肝癌HepG2/mTOR+細胞中mTOR蛋白的表達,呈濃度依賴性。COE能降低凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-2L12的表達,同時增加Bax、Caspase-3的表達量,呈濃度依賴性。隨著藥物濃度的增加,COE降低mTOR信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白的表達量,尤其是明顯降低4E-BP1、p-4E-BP1、P70和p-P70蛋白的表達水平。結(jié)論:COE促進人肝癌HepG2/mTOR+細胞凋亡,其作用機制可能與mTOR信號轉(zhuǎn)導通路及Bcl-2凋亡蛋白家族有關。第四部分南蛇藤提取物與雷帕霉素聯(lián)合應用的療效比較目的:比較南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)與mTOR的抑制劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)聯(lián)合應用對人肝癌HepG2/mTOR+細胞的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2/mTOR+細胞,分為COE組(80mg/L)、RAPA組(100 nmol/L)、COE+RAPA組,同時設立野生型細胞對照組和陰性藥物對照組。24h后,倒置顯微鏡及透射電鏡觀察細胞形態(tài)學改變;流式細胞術檢測各組藥物對人肝癌HepG2/mTOR+細胞凋亡的影響;Western blot法檢測各組目的蛋白的表達水平。結(jié)果:與未加藥陰性對照組相比,COE或RAPA均能抑制肝癌細胞增殖,促進肝癌細胞凋亡。與單獨使用COE或RAPA的治療組相比,COE和RAPA的聯(lián)合治療顯示出一定的協(xié)同效應。結(jié)論:COE與雷帕霉素聯(lián)用可進一步促進腫瘤細胞凋亡。
【圖文】：

邐楊婷南蛇藤提取物靶向ｍＴＯＲ促進人肝癌ＨｅｐＧ２細胞凋亡的分子機制研宄邋２３逡逑３結(jié)果逡逑３．１重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后人肝癌ＨｅｐＧ２細胞形態(tài)變化逡逑將ＧＶ２３８－ｍＴＯＲ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌ＨｅｐＧ２細胞，同時轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒為陽性對逡逑照，以野生型細胞為陰性對照。轉(zhuǎn)染２４邋ｈ后，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。如圖逡逑１－１所示，野生型和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞貼壁生長，細胞輪廓清晰，結(jié)構(gòu)呈梭形，細胞逡逑壁光滑無突起，，且折光性良好，細胞核質(zhì)均勻。ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ＋細胞，大部分形態(tài)與野生逡逑型無顯著差異，但有部分細胞變圓。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

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本文編號：2640612