【摘要】：目的:研究薯蕷皂苷(Dioscin)對大鼠髓核細胞氧化應激損傷的保護作用;并探討藥物作用的可能機制。方法:提取SD大鼠原代髓核細胞培養(yǎng)至第二代用于實驗研究。構建體外髓核細胞過氧化氫誘導氧化應激模型。使用不同濃度的Dioscin和過氧化氫干預髓核細胞,通過CCK8細胞活性檢測,確定Dioscin最佳實驗濃度并分組實驗。Annexin V-FITC/PI流式細胞學技術檢測髓核細胞凋亡情況;檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性;檢測丙二醛(MDA)含量;DCFH-DA探針檢測細胞內活性氧(ROS)含量;免疫熒光檢測細胞內ROS和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)分布;免疫印跡(Western Blot)分析髓核細胞內凋亡調控蛋白(Caspase3、Caspase9和Bax)、炎癥介質(INOS、COX2、IL-6)、金屬蛋白酶(MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5)、基質合成代謝因子(Collagen2及SOX9)、通路蛋白(NOX4、p-p65/p65、p-JNK/JNK)的表達情況。結果:本研究發(fā)現(xiàn)200u M的過氧化氫可以使髓核細胞的活性降低51%,被用于構建體外大鼠髓核細胞氧化應激模型。濃度范圍低于600n M的Dioscin對大鼠髓核細胞無明顯毒性,同時200n M的Dioscin可以明顯改善過氧化氫導致的大鼠髓核細胞活性下降。Dioscin可以下調凋亡蛋白Caspase3、Caspase9和Bax的表達水平,抑制H_20_2誘導的大鼠髓核細胞的線粒體凋亡。Dioscin通過減少ROS和MDA的生成、增強SOD的活性恢復大鼠髓核細胞內氧化還原平衡。Dioscin抑制過氧化氫誘導的細胞內INOS、COX2、IL-6的水平升高,減輕大鼠髓核細胞的炎癥反應損傷。Diosicn可以阻斷過氧化氫刺激引起的ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13等基質金屬蛋白酶的過表達,同時上調包括Collagen2、SOX9在內的合成因子的蛋白水平。過氧化氫可以誘導NOX4的高表達,而Dioscin通過下調NOX4表達水平,降低NF-κB和JNK通路蛋白的磷酸化,從而抑制NF-κB和JNK通路的激活。結論:本研究表明,髓核細胞在氧化應激下可以通過激活Nox4/NF-κB/JNK通路促進炎癥介質的釋放,上調椎間盤基質分解代謝因子并導致基質分解過度,最終加速椎間盤的退變。Dioscin可以抑制ROS生成,重建髓核細胞內的氧化與抗氧化平衡,改善髓核細胞內的炎性環(huán)境,保護髓核細胞免于氧化應激損傷。因此,Dioscin在椎間盤退變中具有潛在的治療前景。
【圖文】：

17圖 1：Dioscin 及 H2O2對大鼠髓核細胞活性的影響。（A）不同濃度的 H2O2（0、100uM、200uM、300uM、400uM）對大鼠髓核細胞活性的影響；（B）不同濃度的 Dioscin（0、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM）對大鼠髓核細胞的毒性；（C）不同濃度的 Dioscin 對 H2O2干預下大鼠髓核細胞活性的保護作用。##，，p ＜ 0.01（vs 對照組）；**，p ＜ 0.01（Dioscin 組 vs H2O2組）

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文圖 3：Dioscin 對大鼠髓核細胞內 ROS、MDA 及 SOD 表達水平的影響不同干預條件下大鼠髓核細胞內活性氧（ROS）的流式檢測；（B）大鼠胞內 ROS 表達水平的定量分析；（C）ROS 在大鼠髓核內分布情況的免檢測；（D）大鼠髓核細胞內超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測；（F）核細胞內丙二醛（MDA）的表達情況。## 表示 p ＜ 0.01（相比于對照** 表示 p ＜ 0.01（Dioscin 組與 H2O2組比較）。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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