【摘要】：研究背景:隨著當代社會節(jié)奏的加快,各種燒傷創(chuàng)傷經(jīng)常出現(xiàn),人口逐漸趨于老年化,糖尿病、放射性治療、壓力大等引起的慢性潰瘍發(fā)病率明顯增加,且創(chuàng)面愈合的病程也會增長。因此,越來越多的研究開始重點關注創(chuàng)面愈合。積雪草苷霜軟膏的有效成分是從傘形科積雪草的全草中提取出來,已應用于臨床上手術創(chuàng)傷、燒傷、外傷的治療,具有促進創(chuàng)傷愈合的作用。積雪草苷促進創(chuàng)面愈合的確切機制尚未明確,但這方面的研究已成為學者們關注的熱點,特別是其促進燒傷創(chuàng)面愈合的分子機制的研究。目的:為了進一步深入研究積雪草苷在促進燒傷創(chuàng)面愈合的分子機制,觀察在積雪草苷作用下,燒傷創(chuàng)面愈合過程中細胞周期蛋白(Cyclin)及增殖細胞核抗原(PCNA)表達的變化以探討其對細胞增殖的作用機制,并通過研究積雪草苷對燒傷創(chuàng)面組織的炎癥因子及NF-κ B信號通路的影響情況以探討其抑制炎癥的作用機制。方法:第一部分:建立深Ⅱ°燙傷動物模型72只,采用對照的方法,將大鼠的創(chuàng)面根據(jù)不同處理方式分為兩組,分別為積雪草苷用藥組和對照組,觀察并記錄創(chuàng)面愈合情況,取傷后第1、3、7、11、14、17天創(chuàng)面標本,分別行HE染色和免疫組織化學染色,以觀察細胞增生情況和CyclinB1、CyclinC、CyclinD1、PCNA表達情況。兩組創(chuàng)面采用配對資料t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。第二部分:取Wistar大鼠深Ⅱ°燙傷動物模型創(chuàng)面組織細胞進行細胞培養(yǎng),取培養(yǎng)所得細胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后分為4組:對照組(未加藥物)和三個不同劑量積雪草苷藥物組,每組均以2～3 ×104個/mL的密度接種于96孔板,每組8孔,其中空白組不加藥物,三個藥物組積雪草苷終濃度分別為10-7、10-6及10-mnol/mL,所有細胞分組處理后培養(yǎng)12h。應用MTT法檢測積雪草苷對燙傷上皮組織細胞增殖的影響,應用免疫組織化學檢測創(chuàng)面上皮組織巨噬細胞的數(shù)量,應用ELISA檢測上清液中TNF-α、IL-1及IL-10的表達情況:應用Western blot法檢測創(chuàng)面組織中NFkBP65蛋白表達;應用激光共聚焦顯微鏡檢測NF-K B的活化情況(主要亞基p65轉運到細胞核內情況)。結果:第一部分:①創(chuàng)面愈合時間:72例Wistar大鼠深11°燙傷模型建立成功,創(chuàng)面愈合時間方面,積雪草苷治療組的愈合時間為(17.40±3.15)d;明顯早于非藥物對照組的(22.17±4.02)d,其中對照組還出現(xiàn)1例因創(chuàng)面感染在25 d才完全,兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。②HE染色:積雪草苷治療組于第3天可見明顯增生的表皮細胞,而對照組至第7天可見明顯增生的表皮細胞。③傷后第1、3、7、11、14、17天創(chuàng)面標本免疫組織化學染色結果顯示,積雪草苷組CyclinB1、PCNA表達均明顯高于對照組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而Cycl inC、CyclinD1表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。第二部分:①通過MTT法檢測細胞生長情況:與對照組相比,積雪草苷三個劑量組對細胞增殖均無顯著影響(P0.05),表明上述濃度的積雪草苷對上皮組織細胞無細胞毒性作用,具有一定的安全性。②積雪草苷治療組第3、7、1 1、14天創(chuàng)面浸潤巨噬細胞數(shù)量均少于對照組。③ELISA檢測上清液中TNF-α、IL-1及IL-10的表達:與空白組的比較,積雪草苷在各個劑量組中都不同程度的抑制了TNF-α以及IL-1的過高表達(P0.05),且各積雪草酸組中隨著濃度的增加,TNF-α及IL-1的表達呈下降趨勢;積雪草苷各劑量組IL-10的表達則明顯高于空白組,隨劑量增加呈上升趨勢。④WB法檢測傷后第7天創(chuàng)面組織中NFkBP65蛋白表達,積雪草苷組低于對照組。⑤激光共聚焦顯微鏡下觀察NF-κB核轉運情況:空白組陽性細胞百分率為(80.20±8.11)%,紅染p65亞基主要集中在胞核,說明p65亞基轉運入核明顯;積雪草苷各劑量組p65轉運入核的細胞百分率明顯降低,呈劑量依賴性,四組之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=F=24.172,P0.001);與對照組相比,積雪草苷10-6moL/mL組(t=3.535,P=0.001)和積雪草苷10-5moL/mL組(t=6.675,P0.001)差異有統(tǒng)計學意義。結論①積雪草苷可通過提高CyclinB1、PCNA的表達促進燒傷創(chuàng)面的愈合。了解積雪草苷促進燒傷創(chuàng)面的愈合機制,可以有針對性的聯(lián)合其他藥品,共同用藥,幾種藥物效果疊加,充分利用不同的促進愈合機制,整體加速創(chuàng)面的愈合,縮短愈合時間。②積雪草苷可通過抑制NF-κB主要亞基p65蛋白的核轉運來抑制炎癥反應的過度表達。了解積雪草苷抑制炎癥反應的機制,結合燒傷創(chuàng)面炎癥反應的時間特點,在創(chuàng)面的炎癥期,有針對性的使用,可以減輕創(chuàng)面炎癥反應,促進創(chuàng)面愈合,縮短愈合時間。③積雪草苷應用于燒傷創(chuàng)面的治療具有實用性,在燒傷創(chuàng)面早期即可以使用。創(chuàng)新性:對積雪草苷促進燒傷創(chuàng)面愈合和發(fā)揮抗炎作用的分子機制進行了研究,對其在燒燙傷創(chuàng)面開始使用的時間進行了預判斷。從促進創(chuàng)面愈合,縮短愈合時間這一根本問題在臨床上的使用,提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖２－１冊染色
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2634179