【摘要】：目的:通過體內外實驗觀察活血通督湯對小膠質細胞P2X7受體介導炎癥的調控作用,探討活血通督湯對急性脊髓損傷后炎癥的作用和機制。方法:1.將144只SPF級SD大鼠(雌雄各半)采用隨機數(shù)表法隨機分為假手術組(Sham)、模型組(Model)、活血通督湯組(HXTDD)、BBG組(BBG)、BzATP組(BzATP)和BzATP+活血通督湯組(BzATP+HXTDD),每組24只。Sham組僅行椎板切除術,其余各組均采用MASCIS脊髓打擊器制備急性脊髓損傷模型。Sham組和Model組自術后第1d起,每日給予生理鹽水灌胃;HXTDD組自術后第1d起,每日給予活血通督湯灌胃;BBG組自術后第1d起,每日給予BBG腹腔注射;BzATP組于造模前1h給予BzATP腹腔注射,自術后第1d起,每日給予生理鹽水灌胃;BzATP+HXTDD組于造模前1h給予BzATP腹腔注射,自術后第1d起,每日給予活血通督湯灌胃。干預3d后,各組大鼠處死、取材。采用尼氏染色觀察脊髓和神經元的宏觀形態(tài)和結構;采用透射電子顯微鏡觀察髓鞘和神經元的微觀結構和形態(tài);采用高爾基染色觀察脊髓樹突和樹突棘形態(tài),并計算樹突長度和樹突棘數(shù)量;采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察P2X7R+/IBA1+陽性細胞,并計算P2X7R+/IBA1+陽性細胞數(shù);采用Elisa法檢測IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達水平;采用Western blot法檢測P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達情況;采用比色法檢測脊髓組織中Caspase1的活性;采用熒光定量PCR檢測P2X7R mRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、IL-18mRNA 和 TNF-αmRNA 表達情況。2.體外培養(yǎng)BV-2小膠質細胞,傳代至第3代進行實驗。應用LPS預處理BV-2小膠質細胞,再給予BzATP刺激,建立炎癥細胞模型。采用MTT法篩選活血通督湯安全濃度范圍。將第3代體外培養(yǎng)的BV-2小膠質細胞種板,分為空白對照組(Control)、LPS 組(LPS)、BzATP 組(BzATP)、活血通督湯組(HXTDD)和 A438079 組(A438079)。Control組正常培養(yǎng);LPS組給予LPS處理;BzATP組給予LPS處理后再給予BzATP處理;HXTDD組給予LPS處理后再同時給予BzATP和活血通督湯處理;A438079組給予LPS處理后再同時給予BzATP和A438079處理。干預完成后,收集細胞和培養(yǎng)基上清液。采用MTT法檢測細胞活力,以確定后續(xù)實驗中活血通督湯最佳藥物干預濃度;采用Elisa法檢測IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達情況;采用Western blot法檢測BV-2小膠質細胞中P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達情況;采用比色法檢測BV-2小膠質細胞中Caspase1活性;采用qPCR檢測BV-2小膠質細胞中P2X7RmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達情況。結果1第一部分實驗結果1.1活血通督湯對脊髓和神經元形態(tài)學的影響:尼氏染色顯示活血通督湯和BBG可改善急性脊髓損傷后脊髓和神經元的宏觀形態(tài);透射電子顯微鏡顯示活血通督湯和BBG可改善急性脊髓損傷后髓鞘和神經元的微觀結構和形態(tài);高爾基染色顯示,HXTDD組和BBG組的樹突長度和樹突棘數(shù)量顯著多于Model組、BzATP組和BzATP+HXTDD組(P＜0.05);激光共聚焦掃描顯微鏡顯示,HXTDD組和BBG組的P2X7R+/IBA1+細胞數(shù)顯著少于Model組、BzATP組和BzATP+HXTDD組(P0.05)。1.2活血通督湯對炎性因子表達的影響:與Sham組比較,各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達水平顯著增高(P0.05);HXTDD組和BBG組的IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α表達水平顯著低于 Model 組、BzATP 組和 BzATP+HXTDD 組(P0.05)。1.3活血通督湯對P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達的影響:與Sham組比較,各組大鼠脊髓組織中P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達量顯著增高(P0.05);HXTDD組和BBG組的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達量顯著低于Model組、BzATP 組和 BzATP+HXTDD 組(P0.05)。1.4活血通督湯對Caspase1活性的影響:與Sham組比較,各組大鼠脊髓組織中Caspase1活性顯著增高(P＜0.05);HXTDD組和BBG組的Caspase1活性顯著低于Model組、BzATP 組和 BzATP+HXTDD 組((P＜0.05)。1.5 活血通督湯對 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-αmRNA表達的影響:與Sham組比較,各組大鼠脊髓組織中P2X7RmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達量顯著增高(p0.05);HXTDD 組和BBG 組的 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達量顯著低于 Model 組、BzATP 組和 BzATP+HXTDD 組(p0.05)。2第二部分實驗結果2.1活血通督湯安全濃度范圍:活血通督湯在50μg/mL～600μg/mL的濃度范圍內對BV-2小膠質細胞無毒,不影響其細胞活力。2.2活血通督湯對細胞活力的影響:與Control組比較,LPS預處理可降低細胞活力(P0.05);LPS預處理后再使用BzATP處理,進一步降低細胞活力(P＜0.05);200μg/mL和400μg/mL濃度的活血通督湯以及A438079可改善經LPS預處理后再經BzATP處理的BV-2小膠質細胞活力(P＜0.05);且200μg/mL濃度的活血通督湯對經LPS預處理后再經BzATP處理的BV-2小膠質細胞活力的改善作用優(yōu)于400μg/mL濃度的活血通督湯,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。因此,活血通督湯的最佳干預濃度被確定為200μg/mL,在后續(xù)實驗中均使用200μg/mL濃度的活血通督湯進行干預。2.3活血通督湯對炎性因子表達的影響:與Control組比較,其余各組培養(yǎng)基上清液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達水平顯著升高(P＜0.05),HXTDD組和A438079組培養(yǎng)基上清液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達水平顯著低于BzATP組(P＜0.05)。2.4活血通督湯對P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達的影響:與Control組比較,其余各組BV-2小膠質細胞的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達量顯著增高(P0.05);HXTDD組和A438079組BV-2小膠質細胞的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表達量顯著低于BzATP組(P0.05)。2.5活血通督湯對Caspase1活性的影響:與Control組比較,其余各組BV-2小膠質細胞的Caspase1活性顯著增高(P0.05);HXTDD組和A438079組BV-2小膠質細胞的Caspase1活性顯著低于BzATP組(P0.05)。2.6 活血通督湯對 P2X7RmRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-αmRNA表達的影響:與Control組比較,其余各組BV-2小膠質細胞的P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達量顯著增高(P0.05);HXTDD 組和 A438079 組的 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA和TNF-α mRNA表達量顯著低于BzATP組(P0.05)。結論1活血通督湯可抑制急性脊髓損傷后炎癥,有效保護損傷處神經元、髓鞘、樹突和樹突棘的形態(tài)結構,減輕炎癥對神經系統(tǒng)的損傷�；钛ǘ綔淖饔脵C制與其抑制急性脊髓損傷后小膠質細胞P2X7受體介導的炎癥有關。2活血通督湯可在不影響細胞活力的情況下,抑制細胞炎癥,下調相關炎性因子表達水平,其機制與活血通督湯抑制小膠質細胞P2X7受體介導的炎癥有關。
【圖文】：

４實驗結果逡逑４．１尼氏染色觀察脊髓神經元組織形態(tài)逡逑如圖１－１和圖１－２所示：Ｓｈａｍ組脊髓灰質呈蝴蝶狀，結構完整，灰質和白質界限清逡逑晰，神經元胞質內可見斑塊狀或虎斑樣尼氏體，尼氏體飽滿、清晰，神經元細胞核大，逡逑核仁明顯；Ｍｏｄｅｌ組、ＢｚＡＴＰ組和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ組脊髓結構破壞嚴重，神經元胞質逡逑內尼氏體較小、碎裂，神經元固縮壞死，溶解、液化后形成較多空泡樣結構；ＨＸＴＤＤ逡逑組和ＢＢＧ組脊髓結構較Ｍｏｄｅｌ組、ＢｚＡＴＰ組和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ組有所改善，神經元胞逡逑質內尼氏體較多、較飽滿，神經元水腫較輕，神經元形態(tài)較好，，空泡樣改變較少，損傷逡逑神經元處于恢復狀態(tài)中，但仍有部分神經元細胞核腫大，核仁消失。說明急性脊髓損傷逡逑后，損傷處神經細胞被嚴重破壞，活血通督湯和Ｐ２Ｘ７Ｒ抑制劑ＢＢＧ能夠減輕急性脊髓逡逑損傷后脊髓和神經元的損傷

注：黑色箭頭所示為瘀血，紅色箭頭所示為尼氏體。逡逑４．２透射電子顯微鏡觀察髓鞘和神經元組織形態(tài)逡逑如圖１－３所示，透射電子顯微鏡顯示：Ｓｈａｍ組脊髓髓鞘外形規(guī)則，呈同心圓狀排逡逑列，結構完整、無破裂、無缺失，板層結構完整、致密、均勻，排列規(guī)則，神經元線粒逡逑體豐富、飽滿且清晰可見，分布均勻，微絲、微管豐富，神經元呈橢圓形，細胞膜結構逡逑完整，細胞器豐富，可見較多線粒體和粗面內質網，線粒體嵴無明顯斷裂或缺失；Ｍｏｄｅｌ逡逑組、ＢｚＡＴＰ組和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ組脊髓髓鞘外形不規(guī)則，結構紊亂，厚薄不一，不完逡逑整，部分髓鞘可見斷裂或缺失，局部卷曲、皺褶，板層結構松解、扭曲、皺褶、融合甚逡逑至部分破裂、缺失，神經元線粒體腫脹，數(shù)量減少甚至部分線粒體溶解消失，線粒體嵴逡逑斷裂、缺失，微絲、微管溶解，數(shù)量較少；ＨＸＴＤＤ組和ＢＢＧ組脊髓髓鞘形態(tài)有所改逡逑善
【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2626331