【摘要】：目的:環(huán)孢素A(Cyclosporine A,CsA)是臨床上常用的一種強(qiáng)有效的免疫抑制劑,普遍用于免疫性疾病及人體器官移植術(shù)后。但隨著CsA的廣泛使用,其毒副作用也日漸明顯,包括對腎臟、肝臟在內(nèi)的人體主要器官的毒性作用被相繼報(bào)道。然而臨床上器官移植術(shù)后,術(shù)者需服用相當(dāng)長時(shí)間的高劑量的環(huán)孢素A以抵抗免疫排斥,這就為藥物毒性的出現(xiàn)提供了誘導(dǎo)條件。雖然臨床上患者服用CsA伴隨著血藥濃度的監(jiān)控,但只能通過降低CsA的用藥劑量來控制毒副作用的損害且對患者術(shù)后恢復(fù)及生活質(zhì)量造成影響。本研究擬在代謝組學(xué)技術(shù)的支持下,探尋CsA肝腎毒性發(fā)生的體內(nèi)生物標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)CsA毒性作用產(chǎn)生的相關(guān)代謝路徑,并結(jié)合當(dāng)前臨床患者配伍服用五味子類制劑前提條件及課題組前期五味子提取物的相關(guān)研究,闡明五味子醇提物對CsA肝腎毒性保護(hù)機(jī)制的機(jī)制,為CsA的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。方法:1.五味子醇提物指紋圖譜的建立通過對比不同流動(dòng)相系統(tǒng)、柱溫、流速和檢測波長下的色譜圖譜,優(yōu)化并確定色譜條件;運(yùn)用中藥指紋色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對10批次五味子醇提物色譜圖進(jìn)行相似度評價(jià),建立五味子醇提物HPLC指紋圖譜。2.CsA誘導(dǎo)大鼠肝腎損傷的代謝組學(xué)研究根據(jù)臨床成人器官移植術(shù)后CsA維持的高劑量及時(shí)間,換算大鼠生物等效劑量為50 mg/kg·d~(-1),作用時(shí)間為7天。分別給予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA 1天、3天、7天,觀察對不同時(shí)間CsA作用下各組大鼠影響。檢測各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)評價(jià)大鼠肝臟功能水平;檢測各組大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)評價(jià)大鼠腎臟功能水平。大鼠肝臟腎臟組織進(jìn)行HE染色觀察組織病理損傷。收集各組大鼠犧牲前24h尿液,采用LC-MS/MS手段收集尿液中代謝離子信息,運(yùn)用XCMS軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,其中代謝物的鑒定和代謝通路分析基于數(shù)據(jù)庫KEGG(http://www.kegg.jp/)。3.五味子醇提物對CsA大鼠肝腎毒性保護(hù)作用機(jī)制研究在第二章研究基礎(chǔ)上,本章依據(jù)臨床高劑量維持時(shí)間增加CsA處理14天組別,用于驗(yàn)證五味子醇提物對CsA肝腎毒性的影響。分別給予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA及聯(lián)合給予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1) 3天、7天、14天,觀察對不同時(shí)間五味子醇提物對CsA大鼠的影響。檢測各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)用以評價(jià)大鼠肝臟功能水平;檢測各組大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)用以評價(jià)大鼠腎臟功能水平;大鼠肝臟腎臟組織進(jìn)行HE染色觀察組織病理損傷;檢測肝腎組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)用以評價(jià)大鼠氧化應(yīng)激水平;Western Blot檢測大鼠肝臟、腎臟4HNE、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、Casepase-3、Bax、及Bcl-2表達(dá)水平,研究五味子醇提物保護(hù)CsA大鼠肝腎毒性作用的機(jī)制。結(jié)果:1.建立五味子醇提物HPLC指紋圖譜。10批次五味子醇提物液相色譜圖譜共標(biāo)示了15個(gè)共有峰,并對其中四個(gè)共有峰進(jìn)行了成分指認(rèn),分別是五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素,且10批次五味子醇提物的相似度均在0.942以上。2.CsA 50 mg/kg·d-1分別作用處理大鼠1天、3天、7天,傳統(tǒng)肝腎毒性損傷指標(biāo)表明1天組大鼠肝臟功能指標(biāo)(ALT、AST)和腎臟功能指標(biāo)(CRE、BUN)未出現(xiàn)明顯改變,3天和7天組肝臟和腎臟功能指標(biāo)出現(xiàn)顯著性差異變化;同時(shí)病理組織結(jié)果顯示:1天組肝腎組織未出現(xiàn)改變,而3天組可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤,7天組可見明顯病理結(jié)構(gòu)改變表明肝臟腎臟毒性的形成。收集各大鼠24h尿液,并運(yùn)用LC-MS/MS對收集到的尿液進(jìn)行代謝物分析。經(jīng)過LC-MS/MS技術(shù)檢測,分析質(zhì)譜下機(jī)數(shù)據(jù)共得到鑒定離子11555個(gè)。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差分析(RSD≤30%)后共篩選出差異離子7657個(gè),其中1天組3469個(gè),包含2532個(gè)上調(diào)離子和937個(gè)下調(diào)離子;3天組3403個(gè),包含2360個(gè)上調(diào)離子和1043個(gè)下調(diào)離子;7天組5393個(gè),包含2283個(gè)上調(diào)離子和3110個(gè)下調(diào)離子。運(yùn)用差異倍數(shù)分析及t檢驗(yàn)分析并取3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白組對比后的數(shù)據(jù)交集,通過篩選三組共同存在的代謝產(chǎn)物,共得到697個(gè)代謝離子物。在697個(gè)鑒定的差異代謝物中,再通過KEGG富集分析及HMDB富集分析,15種代謝物被選為可能的代謝標(biāo)志物,包括氨基天冬氨酸、尿酸、絲氨酸磷酸乙醇胺、D-4'-磷酸泛酸、二磷酸脫氧胞苷、脫氧尿苷二磷酸鹽、氨乙基磷酸鹽、二碘酪氨酸、二磷酸胞苷乙醇胺、腺苷酸琥珀酸、胞磷膽堿、脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧次黃苷三磷酸鹽、乙酰胞壁酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。15種代謝標(biāo)志物涉及的代謝通路包括嘧啶代謝、嘌呤代謝、氨基酸代謝、甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝。3.為了驗(yàn)證五味子醇提物對CsA大鼠肝腎毒性的影響,分別給予大鼠CsA 50 mg/kg·d~-11 3天、7天、14天,并在給與CsA的同時(shí)給予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1),其中單獨(dú)給予CsA組大鼠肝臟腎臟毒性改變隨時(shí)間的延長而加重,但同時(shí)給予CsA和五味子醇提物的大鼠肝腎毒性明顯減輕,表現(xiàn)在肝腎功能及病理方面。其中在14天組實(shí)驗(yàn)中,在CsA能夠精準(zhǔn)造成肝腎病理改變的情況下,五味子醇提物能夠明顯延緩肝腎組織病理發(fā)生改變。同時(shí)五味子醇提物能夠提高肝腎組織中MDA、SOD、CAT、GSH水平的改變。Western Blot結(jié)果顯示五味子醇提物能夠上調(diào)組織中Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM和Bcl-2的表達(dá)水平,下調(diào)組織中Casepase-3、Bax表達(dá)水平。結(jié)論:本研究成功建立五味子醇提物指紋圖譜,為五味子醇提物的提取方法及質(zhì)量控制提供保證;用LC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)方法,成功篩選出CsA誘導(dǎo)肝腎毒性的大鼠體內(nèi)生物標(biāo)志物,為CsA早期肝腎毒性的診斷提供了可靠依據(jù);五味子醇提物對大鼠CsA誘導(dǎo)肝腎毒性的保護(hù)作用機(jī)制可能是激活Nrf2信號(hào)通路調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和抑制組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生來實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2623657