【摘要】：目的觀察不同濃度IL-1β對兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖的影響,并研究不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松對IL-1β介導的兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖、遷移的抑制作用及其對NF-κB信號通路的影響,從而探討乳香揮發(fā)油及地塞米松的抗炎作用及其分子機制。方法1.采用MTT法檢測不同劑量IL-1β作用于兔RPE細胞24h、48h、72h后對兔RPE細胞增殖的影響,并篩選最佳干預濃度、時間;同時采用MTT法檢測不同濃度乳香揮發(fā)油(0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.45mg/mL、0.6mg/mL、0.75mg/mL)及陽性對照藥物地塞米松(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/mL、400 mg/L、600 mg/L)對IL-1β介導的兔RPE細胞增殖的影響。采用流式細胞儀檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松對IL-1β介導的細胞凋亡的影響。根據(jù)MTT檢測結(jié)果及凋亡率檢測結(jié)果篩選乳香揮發(fā)油低、中、高濃度組(0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL)及陽性對照藥物地塞米松低、中、高濃度組(50mg/L、100mg/L、400mg/L)。采用流式細胞儀檢測低、中、高濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松對IL-1β作用下細胞增殖周期的影響。劃痕實驗觀察低、中、高濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松對IL-1β介導的細胞遷移的影響。采用蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測低、中、高濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松對IL-1β作用下兔RPE細胞中NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表達量的影響。免疫細胞化學染色法觀察乳香揮發(fā)油對IL-1β作用下兔RPE細胞NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表達的影響。結(jié)果1.MTT法檢測不同濃度IL-1β干預24h、48h、72h對兔RPE細胞增殖的影響同時相內(nèi)不同處理組之間比較:與無血清DMEM組比較,各時相內(nèi)各IL-1β組細胞存活率均顯著增大,尤以濃度為10g/L時最為明顯(P0.01),當濃度小于10g/L時,IL-1β對兔RPE細胞的促增殖作用具有濃度依賴性,24h時相內(nèi),除外20g/L IL-1β、30g/L IL-1β組,其他各組與無血清DMEM組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01);48h時相,各濃度組IL-1β與無血清DMEM組差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01);72h時相,各濃度組IL-1β與無血清DMEM組差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。同一處理組內(nèi)不同時相之間比較:各處理組細胞存活率均隨時間延長有所增加,即IL-1β對兔RPE細胞的促增殖作用具有時間依賴性,綜合以上,選取濃度為10g/L的IL-1β干預兔RPE細胞進行后續(xù)實驗。2.MTT法檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h對IL-1β作用下的兔RPE細胞存活率的影響10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較顯著促進兔RPE細胞增殖,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒對照組(P0.05),其他各處理組與IL-1β組比較均顯著抑制兔RPE細胞增殖,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油及地塞米松對細胞增殖抑制能力越顯著,具有濃度依賴性。0.3mg/mL乳香揮發(fā)油組與100mg/L地塞米松組比較無明顯差異(P0.05)。3.Annexin-VFITC/PI復染FCM檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h對IL-1β作用下的兔RPE細胞凋亡率的影響早期凋亡率比較:10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較其早期凋亡率明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒對照組及50mg/L地塞米松(P0.05),其他各處理組與IL-1β組比較早期凋亡率均明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油及地塞米松處理細胞后其早期凋亡率逐漸增大,具有濃度依賴性,0.3mg/mL乳香揮發(fā)油組與100mg/L地塞米松組比較早期凋亡率較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。晚期凋亡率比較:10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較其晚期凋亡率明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒對照組(P0.05),其他各處理組與IL-1β組比較晚期凋亡率明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油及地塞米松處理細胞后其晚期凋亡率逐漸增大,具有濃度依賴性,0.3mg/mL乳香揮發(fā)油組與100mg/L地塞米松組比較晚期凋亡率較低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.PI染色檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h對IL-1β作用下的兔RPE細胞增殖周期的影響10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較其G_1/G_0期細胞數(shù)比例明顯減少,S期及G_2/M期細胞比例明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明IL-1β通過誘導G_1/G_0期細胞向S期及G_2/M期轉(zhuǎn)化從而促進兔RPE細胞增殖,除外0.2%DMSO溶媒對照組(P0.05),其他各處理組與IL-1β組比較G_1/G_0期細胞數(shù)比例均明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油及地塞米松各濃度組處理細胞后其G_1/G_0期細胞數(shù)逐漸增多,具有濃度依賴性,而各處理組與IL-1β組比較S期及G_2/M期細胞數(shù)隨濃度增加其比例逐漸減少,除外高濃度乳香揮發(fā)油組S期與IL-1β組比較無明顯差異(P0.05),其他各組S期及G_2/M期與IL-1β組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01),中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較其G1/G0期細胞較少、S及G2/M期細胞較多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明乳香揮發(fā)油及地塞米松將IL-1β作用后的兔RPE細胞阻滯于G_1/G_0期減緩細胞進入增殖周期,抑制細胞分裂增殖,從而促進細胞凋亡,且乳香揮發(fā)油作用優(yōu)于地塞米松。5.劃痕實驗檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h、48h對IL-1β作用下的兔RPE細胞遷移的影響10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組24h及48h比較其遷移愈合率明顯增大,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明10g/L IL-1β能明顯促進兔RPE細胞的損傷愈合,促進其遷移。除外0.2%DMSO溶媒對照組(P0.05),其他各處理組與IL-1β組比較其遷移愈合率均明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后遷移愈合率逐漸降低,具有濃度依賴性。24h中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較其遷移率較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),48h中濃度乳香揮發(fā)油組與地塞米松組比較其遷移率較低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。6.Western blot法檢測各組細胞中NF-κBp65在胞漿蛋白及核蛋白中的表達量,并計算核轉(zhuǎn)位率空白對照組NF-κBp65蛋白在胞漿及核中均有少量表達,溶媒對照組與其比較無明顯差異(P0.05)。10g/L IL-1β對照組與空白對照組比較,胞漿內(nèi)蛋白表達量減少,細胞核內(nèi)蛋白表達量明顯增多,核轉(zhuǎn)位率顯著提高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),表明10g/L IL-1β能明顯促進NF-κBp65蛋白從胞漿向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。而乳香揮發(fā)油及地塞米松高、中、低處理組與IL-1β組比較核轉(zhuǎn)位率明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后其核轉(zhuǎn)位率逐漸減小,具有濃度依賴性。中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較其核轉(zhuǎn)位率較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。7.Western blot法檢測各組細胞中p-IκBα在胞漿蛋白中的表達量及COX-2在總蛋白中的表達量無血清DMEM組p-IκBα蛋白在胞漿中以及COX-2在總蛋白中均有少量表達,溶媒對照組與其比較無明顯差異(P0.05)。10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較,p-IκBα、COX-2蛋白表達明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),表明10g/L IL-1β能明顯提高p-IκBα、COX-2蛋白表達量。除外乳香揮發(fā)油低濃度組中COX-2蛋白表達與IL-1β組比較無明顯差異(P0.05),其他各處理組及地塞米松高、中、低濃度組與IL-1β組比較則明顯抑制p-IκBα、COX-2蛋白表達,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后蛋白表達量逐漸下降,具有濃度依賴性。中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較p-IκBα、COX-2蛋白在胞漿及總蛋白中的表達量均較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01或P0.05)。8.免疫細胞化學染色法檢測兔RPE細胞NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表達的影響NF-κBp65:空白對照組NF-κBp65在胞漿及核中均有少量表達,呈弱陽性,且胞漿中的表達量較多,10g/L IL-1β對照組與無血清DMEM組比較,NF-κBp65表達量明顯增多,胞漿及核內(nèi)均有表達,且有些細胞核內(nèi)NF-κBp65表達量較胞漿內(nèi)多,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),溶媒對照組與IL-1β對照組比較無明顯差異(P0.05)。而乳香揮發(fā)油及地塞米松高、中、低處理組與IL-1β組比較NF-κBp65表達量明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后其NF-κBp65表達量逐漸減小,具有濃度依賴性。中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較表達量較高具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。p-IκBα:空白對照組p-IκBα在胞漿及核中均有少量表達,且胞漿中的表達量較多,10g/L IL-1β對照組與空白對照組比較,胞漿內(nèi)p-IκBα表達量明顯增多,呈強陽性,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),溶媒對照組與IL-1β對照組比較無明顯差異(P0.05)。而乳香揮發(fā)油及地塞米松高、中、低處理組與IL-1β組比較p-IκBα表達量明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后其p-IκBα表達量逐漸減小,具有濃度依賴性。中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較表達量較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。COX-2:空白對照組COX-2在細胞中有少量表達,呈弱陽性,10g/L IL-1β對照組與空白對照組比較,胞漿內(nèi)表達量明顯增多,呈強陽性,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),溶媒對照組與IL-1β對照組比較無明顯差異(P0.05)。而乳香揮發(fā)油及地塞米松高、中、低處理組與IL-1β組比較COX-2表達明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01),且隨著濃度增大,乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后其COX-2表達量逐漸減小,具有濃度依賴性。中濃度乳香揮發(fā)油組與中濃度地塞米松組比較表達量無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.IL-1β可明顯促進兔RPE細胞增殖,其中濃度為10g/L時促增殖作用最為明顯,當其濃度小于10g/L時,對兔RPE細胞的促增殖作用具有劑量、時間依賴性。2.乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h可顯著抑制IL-1β介導的兔RPE細胞增殖,且隨著濃度增大,抑制作用越顯著。3.乳香揮發(fā)油及地塞米松干預24h可顯著提高IL-1β介導的兔RPE細胞的早期及晚期凋亡率,且隨著濃度增大,凋亡率呈增高趨勢。4.IL-1β通過誘導G_1/G_0期細胞向S期及G_2/M期轉(zhuǎn)化從而促進兔RPE細胞增殖,乳香揮發(fā)油及地塞米松將IL-1β作用后的兔RPE細胞阻滯于G1/G0期減緩細胞進入增殖周期,抑制細胞分裂增殖,從而促進細胞凋亡,呈濃度依賴性,且乳香揮發(fā)油作用優(yōu)于地塞米松。5.乳香揮發(fā)油及地塞米松均能明顯抑制IL-1β介導的兔RPE細胞遷移,且隨著濃度增大,其遷移愈合率呈降低趨勢。6.乳香揮發(fā)油及地塞米松均可有效抑制IL-1β干預后所致的NF-κBp65核轉(zhuǎn)移,及p-IκBα、COX-2蛋白表達量增加,且隨著濃度增大,抑制作用越明顯。
【圖文】：

注：A:空白對照組,B:IL-1β對照組,C:溶媒對照組,D:低劑量乳香揮發(fā)油組,E:中劑量乳香揮發(fā)油組,F:高劑量乳香揮發(fā)油組,G:低劑量地塞米松組,H:中劑量地塞米松組,I:高劑量地塞米松組圖 2 PI 染色檢測乳香揮發(fā)油及地塞米松對 IL-1β作用下的兔 RPE 細胞增殖周期的影響5.劃痕實驗檢測不同濃度乳香揮發(fā)油及地塞米松干預 24h、48h 對 IL-1β 作用下的兔 RPE細胞遷移的影響10g/L IL-1β 對照組與無血清 DMEM 組 24h 及 48h 比較其遷移愈合率明顯增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明 10g/L IL-1β 能明顯促進兔 RPE 細胞的損傷愈合，促進其遷移。除外 0.2%DMSO 溶媒對照組（P>0.05），其他各處理組與 IL-1β 組比較其遷移愈合率均明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且隨著濃度增大，乳香揮發(fā)油各濃度組及地塞米松各濃度組處理細胞后遷移愈合率逐漸降低，具有濃度依賴性，說明乳香揮發(fā)油及地塞米松均能明顯抑制 IL-1β 介導的兔 RPE 細胞遷移。各濃度組間兩

注：A:空白對照組,B:溶媒對照組,C:IL-1β對照組,D:低劑量乳香揮發(fā)油組,E:中劑量乳香揮發(fā)油組,F:高劑量乳香揮發(fā)油組,G:低劑量地塞米松組,H:中劑量地塞米松組,I:高劑量地塞米松組圖 5 免疫細胞化學染色法檢測兔 RPE 細胞 NF-κBp65 蛋白表達53
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2622202