【摘要】：目的:淫羊藿苷(Icariin,ICA)是從淫羊藿總黃酮(EFs)中提取的主要活性化合物,參與許多種類細(xì)胞的細(xì)胞行為(增殖,凋亡和自噬等)的調(diào)節(jié),但淫羊藿苷對氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的作用尚未在國內(nèi)外進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)旨在研究淫羊藿苷對大鼠ASMCs增殖,凋亡和自噬的作用。方法:實(shí)驗(yàn)通過麻醉SD大鼠,分離其氣道,用組織貼塊法及差速貼壁法提取和純化大鼠ASMCs,并通過平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(SMα-肌動(dòng)蛋白)熒光對細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(CCK-8)及Edu增殖試劑盒檢測大鼠ASMCs在不同濃度和不同處理時(shí)間的ICA作用下其細(xì)胞增殖情況。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。通過流式細(xì)胞術(shù)和TdT-UTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測定法檢測細(xì)胞凋亡。Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)cyclinE1,cyclinA1及Caspase-3,LC3蛋白的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測cyclinE1,cyclinA1,Atg3,Atg5和Beclin1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果:通過組織貼塊法成功提取大鼠ASMCs,經(jīng)熒光鑒定純度在95%以上。CCK-8及Edu檢測顯示淫羊藿苷以時(shí)間-劑量依耐性的方式從濃度75μM開始明顯抑制大鼠ASMCs的增殖(P0.01)。流式細(xì)胞儀檢測顯示淫羊藿苷干擾ASMCs細(xì)胞周期,淫羊藿苷處理時(shí),細(xì)胞的S期縮短,G2期延長,cyclin E1和cyclinA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下降。表明淫羊藿苷通過下調(diào)cyclin E1和cyclinA1的表達(dá),影響細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖。Flow Cytometey和TUNEL檢測細(xì)胞凋亡顯示淫羊藿苷促進(jìn)大鼠ASMCs凋亡,濃度為200μM時(shí)最為明顯(P0.01)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可激活凋亡蛋白caspase-3的表達(dá),表明淫羊藿苷可能是通過激活caspase-3相關(guān)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最后通過RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷上調(diào)自噬相關(guān)因子Atg3,Atg5和Beclin1的mRNA的表達(dá),并促使LC3Ⅰ激活轉(zhuǎn)化為LC3II,實(shí)驗(yàn)表明淫羊藿苷可能通過影響自噬相關(guān)因子誘導(dǎo)大鼠ASMCs自噬。結(jié)論:淫羊藿苷抑制ASMCs增殖,干擾細(xì)胞周期,其作用可能與下調(diào)CyclinA1和CyclinE1的表達(dá)有關(guān);并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,激活casepase凋亡相關(guān)途徑;除此之外還可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。實(shí)驗(yàn)表明淫羊藿苷可影響大鼠ASMCs細(xì)胞行為。
【圖文】：

儀器prague Dawley）雌性大鼠，6-8 周齡，體PF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。及配置ICA，純度≥ 98％）購自上海源生物技術(shù) 1 所示。將 ICA 用二甲基亞砜（DMSO）0℃保存，長時(shí)間保存可置于-80℃，注意

結(jié)果 大鼠 ASMCs 在光鏡下的生長特點(diǎn)采用組織塊貼壁法提取大鼠 ASMCs，可見在培養(yǎng)第 4、5 天左并在顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始從組織塊周圍爬出，補(bǔ)液后 3-4 天底，呈現(xiàn)“峰-谷”結(jié)構(gòu)（圖 2，A）。根據(jù)細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異速貼壁法純化后，，可見細(xì)胞呈現(xiàn)梭形星型，多邊形等（圖 2，
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2614518