【摘要】：目的本課題以麻黃、桂枝為研究對(duì)象,通過研究麻黃、桂枝以及兩藥配伍對(duì)KM小鼠行為學(xué)改變,大腦組織形態(tài)學(xué)改變,腦組織神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激因子、NLRP3炎癥因子蛋白的變化來探討桂枝拮抗麻黃中樞毒性作用的研究。本課題從藥效學(xué)角度觀察了桂枝對(duì)麻黃所致小鼠中樞興奮性毒性的抑制作用,同時(shí)也探究了桂枝拮抗麻黃中樞多巴胺神經(jīng)元毒性的作用機(jī)制。方法40只KM小鼠按體重隨機(jī)分為生理鹽水組、麻黃組(10g/kg)、麻黃-桂枝3:2組(10g/kg+6.67g/kg)、麻黃-桂枝3:1組(10g/kg+3.33g/kg)、桂枝組(6.67g/kg),每組8只,各組小鼠每天灌胃(ig)給藥1次,每次給藥容積為0.2ml/10g,連續(xù)14天。于第7天進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn),第12、13天進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn),各組小鼠末次給藥1h后脫頸椎處死取大腦,在冷凍的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗,迅速將大腦切分為左右兩半,取小鼠左半腦用相同方法切分成兩份,分別用錫箔紙包好存放于液氮中,小鼠右半腦固定在4%多聚甲醛中,備用。1.行為學(xué)檢測:實(shí)驗(yàn)給藥第7天晚上進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn),將小鼠放入曠場反應(yīng)箱適應(yīng)5s后觀察并記錄小鼠5min內(nèi)靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)路程。實(shí)驗(yàn)給藥第12天晚上進(jìn)行第一次避暗實(shí)驗(yàn),將小鼠放入避暗箱適應(yīng)5s后,按照流程開始實(shí)驗(yàn)。24h后重復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察并記錄小鼠5min內(nèi)第一次進(jìn)入暗室被電擊的時(shí)間(即潛伏期)以及總共電擊次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù));2.HE染色觀察小鼠腦組織結(jié)構(gòu)損傷:將4%多聚甲醛固定液中小鼠腦組織海馬、皮層與紋狀體部位分離,常規(guī)石蠟包埋,4μm切片,HE染色,顯微鏡下觀察小鼠腦組織海馬、皮層與紋狀體病理損傷變化;3.多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平變化:采用免疫組化法檢測小鼠大腦海馬、紋狀體、皮層中多巴胺(DA)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)含量;4.氧化應(yīng)激水平檢測:采用化學(xué)法按照試劑盒說明書測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量;5.NLRP3炎癥小體檢測:采用免疫印跡法(Western blot)測定腦組織Nod樣受體蛋白3(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)蛋白表達(dá)。結(jié)果1.麻黃桂枝配伍對(duì)KM小鼠曠場實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)的影響曠場實(shí)驗(yàn):與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠自主活動(dòng)明顯增加,表現(xiàn)為靜止時(shí)間降低,運(yùn)動(dòng)的時(shí)間增加,平均運(yùn)動(dòng)距離增加,均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組自主活動(dòng)明顯降低,表現(xiàn)為小鼠靜止時(shí)間增加,運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低,平均運(yùn)動(dòng)降低,且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),麻黃-桂枝3:1組小鼠自主活動(dòng)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。避暗實(shí)驗(yàn):與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠潛伏期明顯縮短(P0.01),錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P0.01),且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組潛伏期延長(P0.01),錯(cuò)誤次數(shù)降低(P0.01),具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。麻黃-桂枝3:1組小鼠潛伏期延長(P0.05),錯(cuò)誤次數(shù)降低(P0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.麻黃桂枝配伍對(duì)KM小鼠海馬、紋狀體、皮層多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠大腦海馬、紋狀體、皮層DA、DAT表達(dá)明顯減少,平均光密度值顯著降低,且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),桂枝組DA、DAT表達(dá)差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組、3:1組不同部位DA、DAT表達(dá)顯著升高,且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),其中3:2組升高更為明顯。3.麻黃桂枝配伍對(duì)KM小鼠海馬、紋狀體、皮層病理形態(tài)學(xué)的影響光鏡下生理鹽水組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊,錐體細(xì)胞的數(shù)量和厚度未見異常,無神經(jīng)細(xì)胞壞死和小膠質(zhì)細(xì)胞增生等現(xiàn)象,紋狀體結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞間隙未見增寬,膠質(zhì)細(xì)胞未見增生,皮層結(jié)構(gòu)正常,被膜完整,皮質(zhì)層神經(jīng)元的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊;與生理鹽水組相比,桂枝組海馬區(qū)、紋狀體、皮層結(jié)構(gòu)基本正常,無明顯差異;麻黃組可見腦海馬區(qū)的CA1區(qū)有較多的錐體細(xì)胞壞死,小膠質(zhì)細(xì)胞增生,紋狀體區(qū)域可見細(xì)胞間中度水腫,組織間隙增寬,膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,皮質(zhì)層神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞分層模糊,神經(jīng)元細(xì)胞散在分布,可見有神經(jīng)元細(xì)胞壞死,被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的衛(wèi)星現(xiàn)象;與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2、3:1組海馬、紋狀體、皮層病變均有不同情況改善。4.麻黃桂枝配伍對(duì)KM小鼠腦組織SOD、MDA、NO、NOS含量的影響與生理鹽水組比較,麻黃組腦組織中SOD活力顯著降低(P0.01),MDA、NO、TNOS、i NOS含量顯著升高(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與麻黃組比較,麻黃-桂枝3:2組,3:1組SOD活力明顯升高(P0.05),MDA、NO、TNOS、i NOS含量明顯降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.麻黃桂枝配伍對(duì)KM小鼠腦組織NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響與生理鹽水組比較,麻黃組腦組織中NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高,且具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與麻黃組比較、麻黃-桂枝3:2組NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達(dá)顯著下降,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),麻黃-桂枝3:1組NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達(dá)均有不同程度降低,且Caspase-1蛋白表達(dá)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.桂枝與麻黃配伍后能夠抑制麻黃對(duì)小鼠的中樞興奮性毒性作用,減少小鼠自主活動(dòng),減少小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的錯(cuò)誤,改善小鼠腦組織海馬、紋狀體、皮層病理損傷情況,麻黃與桂枝之間存在“相畏相殺”的配伍關(guān)系。2.桂枝可能通過升高多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)DA、DAT含量,增加抗氧化活性,減少氧化應(yīng)激損傷,抑制NLRP3炎癥小體上調(diào)從而拮抗麻黃中樞多巴胺神經(jīng)毒性,且具有一定量效關(guān)系,隨著桂枝比例的增加,桂枝拮抗麻黃中樞毒性更為顯著。
【圖文】：

引起的 Ca2+內(nèi)流增加而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[37]。課題組前期采取高效液相色譜-熒光檢測法對(duì)小鼠大腦皮層氨基酸含量進(jìn)行測定結(jié)果同時(shí)表明桂枝配伍麻黃后能升高小鼠腦內(nèi) IAA 神經(jīng)遞質(zhì) GABA、纈氨酸 (Valine, Val)、丙氨酸 (Alanine, Ala)、酪氨酸 (Tyrosine, Tyr) 含量水平，降低麻黃對(duì)氨基酸遞質(zhì)水平含量的不利影響，維持了氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，反映了桂枝殺麻黃，麻黃畏桂枝的配伍關(guān)系[24]。5. 研究思路為了進(jìn)一步探索麻黃中樞神經(jīng)毒性，本實(shí)驗(yàn)以中樞多巴胺神經(jīng)元損傷為切入點(diǎn)，利用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)、HE 染色、免疫組化、Western blot 等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以麻黃、桂枝、麻黃-桂枝藥對(duì)作為研究對(duì)象，，深入研究了麻黃、桂枝以及麻黃-桂枝藥對(duì)對(duì)小鼠大腦中樞多巴胺能神經(jīng)元的作用以及 NLRP3 炎癥小體表達(dá)的影響，擴(kuò)展了麻黃桂枝“相畏相殺”的中樞神經(jīng)毒性作用機(jī)制研究，為提高麻黃臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體的技術(shù)路線圖見圖 1。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 麻黃桂枝配伍對(duì) KM 小鼠行為學(xué)結(jié)果的影響3.1.1 麻黃桂枝配伍對(duì) KM 小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響表 1-3. 麻黃桂枝配伍對(duì) KM 小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響( x s, n＝8)組別 N(只) 劑量(g/kg) 靜止 T(s) 運(yùn)動(dòng) T(s) 運(yùn)動(dòng) D(cm)生理鹽水組 8 - 158.29±33.74 141.78±33.74 1888.69±664.54麻黃組 8 10 108.43±14.83##191.64±14.84##3947.89±1146.19##麻黃-桂枝 3:2 組 8 10+6.67 139.17±14.31**160.89±14.31**2569.41±621.59*麻黃-桂枝 3:1 組 8 10+3.33 126.50±10.00*173.57±10.00*2882.18±420.61*桂枝組 8 6.67 148.55±14.88**151.54±14.88**1812.43±413.81**注：與生理鹽水組比較##P<0.01；與麻黃組比較**P<0.01，*P<0.05
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2608915