【摘要】：目的:以NLRP3炎癥小體通路為切入點,以炎性細胞/組織-炎性細胞因子-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為主線,評價桂枝抗炎有效部位對內(nèi)毒素中毒小鼠的保護作用及抗炎效應(yīng)的分子機制。方法:采用體外和體內(nèi)實驗相結(jié)合,評價桂枝揮發(fā)油和桂皮醛抗炎效應(yīng)的NLRP3炎癥小體通路分子機制。以THP-1巨噬樣細胞為載體,采用不同的NLRP3炎癥小體激活物造模,觀察桂枝揮發(fā)油和桂皮醛對NLRP3炎癥小體信號通路的影響。ELISA法測定細胞上清中ASC、Caspase-1(p20)、pro-IL-1β和IL-1β的含量,Western Blotting法檢測細胞裂解液中NLRP3、ASC、ProCaspase-1和Pro-IL-1β蛋白表達,免疫熒光法測定Cathepsin B、NLRP3和ASC蛋白表達進行驗證。RT-PCR法檢測細胞裂解液中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達,熒光顯微鏡法測定細胞ROS含量。構(gòu)建內(nèi)毒素中毒C57BL/6J小鼠模型,觀察桂枝揮發(fā)油及桂皮醛對小鼠一般狀態(tài)和體重的影響,全自動血細胞計數(shù)儀測定全血WBC和PLT的計數(shù),測定小鼠臟器指數(shù),ELISA法和液相蛋白芯片技術(shù)測定血清中前炎癥因子(IL-1β、IL-18、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ)和趨化因子(MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、M-CSF、GM-CSF和G-CSF)的含量,進行肺組織的病理組織學(xué)觀察,Griess法測定肺組織NO含量,RT-PCR法測定肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、iNOS、p65、IFN-α、IFN-β和STAT1 mRNA的表達,Western Blotting法測定肺組織中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1,Caspase-1(p20)、Caspase-12、IL-1β、COP-1和POP-1蛋白表達,免疫組化法檢測肺組織中P2X7R和Cathepsin B蛋白的表達。構(gòu)建內(nèi)毒素中毒KM種小鼠模型,評價桂枝乙酸乙酯部位及其主要成分桂皮酸對內(nèi)毒素中毒小鼠的抗炎保護作用及機制。測定小鼠臟器指數(shù)和肺臟相對含水量,測定血清中BUN、CRE、ALT、AST及肝組織中SOD、MDA的水平,ELISA法測定血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IFN-γ的含量,進行肺臟、脾臟、肝臟和腎臟的病理組織學(xué)觀察,RT-PCR法測定肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達,Western Blotting法測定肺組織中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1(p20)和Pro-IL-1β蛋白的表達。結(jié)果:以ATP和nigericin為NLRP3炎癥小體激活物時,桂枝揮發(fā)油和桂皮醛能下調(diào)THP-1巨噬樣細胞Pro-Caspase-1、p20、Pro-IL-1β和IL-1β蛋白及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達。其中桂枝揮發(fā)油能顯著降低細胞上清和裂解液中Pro-IL-1β蛋白表達(P0.05),抑制細胞裂解液中NLRP3和IL-1βmRNA的表達(P0.05)。桂皮醛能顯著降低THP-1巨噬樣細胞上清中Caspase-1(p20)水平(P0.05),抑制細胞裂解液中NLRP3、ASC和IL-1βmRNA的表達(P0.05)。此外,桂枝揮發(fā)油和桂皮醛能降低細胞NLRP3和ASC蛋白的相對共定位面積、細胞ROS及Cathepsin B蛋白的表達(P0.05)。給予桂枝揮發(fā)油和桂皮醛后,能改善內(nèi)毒素中毒C57BL/6J小鼠的精神狀態(tài)和活動情況。抑制血清中IL-1β、IL-18、IL-5、IFN-γ、MIP-1β和M-CSF的表達,減少肺組織中嗜中性粒細胞的數(shù)量和NO含量,下調(diào)肺組織中NLRP3、p20、Pro-IL-1β和P2X7R蛋白表達,下調(diào)肺中NLRP3、IL-1β、iNOS、IFN-βmRNA表達(P0.05)。此外,桂枝揮發(fā)油還能減少血清MCP-1的分泌和肺中STAT1 mRNA表達,桂皮醛能下調(diào)肺中Cathepsin B蛋白表達及升高COP-1蛋白水平(P0.05)。桂枝乙酸乙酯部位和桂皮酸能增加內(nèi)毒素中毒小鼠的胸腺指數(shù),減少模型小鼠血清中BUN、IL-18和TNF-α的含量,下調(diào)肺中NLRP3和p20蛋白及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達,并對脾和肺臟損傷有改善作用,對抗脾臟中淋巴細胞凋亡及減少肺中嗜中性粒細胞的數(shù)量。此外,桂枝乙酸乙酯部位能顯著減少血清中CRE和肝臟中MDA含量,增加肝臟SOD活力和血清IFN-γ含量,顯著下調(diào)Pro-IL-1β蛋白的表達。桂皮酸還能顯著降低肺含水量和血清IL-1β水平(P0.05)。結(jié)論:桂枝揮發(fā)油、乙酸乙酯部位及桂皮醛、桂皮酸均可通過它們的抗炎活性,發(fā)揮對內(nèi)毒素中毒小鼠的保護作用�？寡讬C制與抑制NLRP3炎癥小體信號通路激活相關(guān)。研究結(jié)果可為解表藥桂枝治療“表證”的臨床運用提供了更為扎實的科學(xué)依據(jù),并豐富了辛味解表藥桂枝“辛散解表”性效理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。
【圖文】：

桂枝揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2017屆博士研究生學(xué)位論文.2 THP-1 細胞的生長曲線及細胞活力采用 MTS 法測定 THP-1 細胞在 72 h 內(nèi)的生長情況發(fā)現(xiàn)，THP-1 細胞在~6 h 的生長存在一個停滯期，在 6 h~72 h 細胞處于對數(shù)生長期，表明可取培2 h 的細胞用于后續(xù)實驗（見圖 1-2）。此外，，經(jīng)臺盼藍法測定細胞活力，結(jié)現(xiàn)所使用 THP-1細胞的活細胞率達 98%。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2603757