【摘要】：目的:近年來(lái),新興的化學(xué)生物學(xué)學(xué)科發(fā)展非常迅猛。該學(xué)科利用現(xiàn)有的數(shù)量龐大而且化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的小分子化合物庫(kù),針對(duì)研究者所需要的化合物的生物活性進(jìn)行篩選,并以此為依據(jù)進(jìn)行相關(guān)的作用機(jī)制研究。本研究所選藥物為小白菊內(nèi)酯和大黃素,二者是從天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明顯的抗癌作用,尤其是腸腺癌,近年來(lái)的研究逐漸增多。因此,延續(xù)我們前期對(duì)小白菊內(nèi)酯和大黃素抗腸腺癌生物活性的研究,本課題采用體外實(shí)驗(yàn)的方式,對(duì)小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡和耐藥逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制靶點(diǎn),以及大黃素誘導(dǎo)CACO-2細(xì)胞凋亡和調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的作用機(jī)制靶點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究。通過(guò)對(duì)小白菊內(nèi)酯和大黃素抗癌活性及作用機(jī)制的研究,為天然植物藥物來(lái)源的小分子化合物抗癌作用提供基礎(chǔ),為天然植物藥物用于臨床腫瘤的治療開(kāi)拓市場(chǎng)。后續(xù),我們將針對(duì)前期的研究成果,對(duì)兩種小分子化合物的生物活性與其結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進(jìn)行分析,對(duì)于不理想的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,為新的抗癌小分子藥物的研發(fā)做出貢獻(xiàn)。研究方法:一、小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡和耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究1、MTT法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞的增殖抑制作用培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞株,加入96孔板,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PTL,對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液,處理12、24、48小時(shí)后,MTT法檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。2、流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡的影響。消化收集對(duì)照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞,AnnexinV/FITC染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析細(xì)胞凋亡百分比。3、吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)熒光染色檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞,每孔1×10~4個(gè)/ml、2ml接種于6孔板中,孔內(nèi)放入蓋玻片。設(shè)小白菊內(nèi)酯濃度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及對(duì)照組共4組,每組3個(gè)復(fù)孔,每組給藥24h后,取出蓋玻片,固定、AO/EB染色、、封片,熒光顯微鏡觀察,每組分別計(jì)數(shù),每次計(jì)數(shù)細(xì)胞300個(gè),計(jì)算凋亡率。4、Western-blot法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞Bax、Bcl-2、蛋白表達(dá)的影響。收集對(duì)照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞蛋白,用western blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。5、MTT法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞,加入96孔板,分別加入不同濃度的VCR,處理24小時(shí)后,MTT法檢測(cè)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞VCR的半數(shù)抑制濃度,及HCT-8/VCR對(duì)VCR的耐藥指數(shù)。(2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-8/VCR細(xì)胞,加入96孔板,分別設(shè)對(duì)照組、PTL5μmol/L、VCR(0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml)、PTL5μmol/L+VCR各濃度組,處理24小時(shí)后,MTT法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。6、流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。消化收集對(duì)照組、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml處理24h的HCT-8/VCR細(xì)胞,AnnexinV/FITC染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析細(xì)胞凋亡百分比。7、Western-blot法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表達(dá)的影響。收集HCT-8對(duì)照組、HCT-8/VCR對(duì)照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8/VCR細(xì)胞蛋白,用western blot方法檢測(cè)P-gp、MRP、GST-π蛋白的表達(dá)。二、大黃素誘導(dǎo)CACO-2細(xì)胞凋亡及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用研究1、MTT法檢測(cè)大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞增殖抑制的影響對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CACO-2細(xì)胞,加入96孔板,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PTL,對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液,處理24小時(shí)后,MTT法檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞凋亡的影響。消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CACO-2細(xì)胞,以大黃素處理CACO-2細(xì)胞24h,終濃度分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析細(xì)胞凋亡百分比。3、DAPI染色檢測(cè)大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CACO-2細(xì)胞,每孔1×104個(gè)/ml、2ml接種于6孔板中,孔內(nèi)放入蓋玻片。設(shè)大黃素濃度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及對(duì)照組共4組,每組3個(gè)復(fù)孔,,每組給藥24h后,取出蓋玻片,固定、DAPI染色、碳酸鹽緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察,激發(fā)波長(zhǎng)為359 nm。觀察細(xì)胞凋亡情況。4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞周期的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CACO-2細(xì)胞,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基制成2×104個(gè)/m1的單細(xì)胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔2ml,37℃培養(yǎng)12小時(shí),更換培養(yǎng)液,加入藥物。大黃素物終濃度分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;對(duì)照組為加入完全培養(yǎng)基組,空白對(duì)照為只加入完全培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用胰酶消化細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1x106個(gè)/ml,取0.25ml細(xì)胞,PBS清洗,1000rpm,4℃離心5分鐘,棄上清(重復(fù)兩次);將細(xì)胞重懸于0.25ml結(jié)合緩沖液中,取0.1ml細(xì)胞懸液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至終濃度50ug/ml,錫箔紙包住,避光4度染色30min,24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。5、Western-blot法檢測(cè)大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)的影響收集對(duì)照組、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黃素處理24h的CACO-2細(xì)胞蛋白,用western blot方法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞的增殖抑制作用小白菊內(nèi)酯對(duì)結(jié)腸癌HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞株有增殖抑制作用,并呈濃度及時(shí)間依賴(lài)關(guān)系,PTL12h半數(shù)抑制濃度IC50分別為20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半數(shù)抑制濃度IC50分別為15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半數(shù)抑制濃度IC50分別為11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡的影響。對(duì)照組HCT-8細(xì)胞凋亡率4.23%±0.75%,與對(duì)照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。對(duì)照組HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡率4.42%±1.16%,與對(duì)照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8/VCR細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述結(jié)果表明PTL以濃度依賴(lài)方式誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡。3、熒光染色檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡的影響熒光染色結(jié)果顯示,PTL以濃度依賴(lài)方式誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡。對(duì)照組HCT-8細(xì)胞凋亡細(xì)胞比率為10.33%±2.05%,與對(duì)照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。對(duì)照組HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡細(xì)胞比率9.42%±1.25%,與對(duì)照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8/VCR細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。對(duì)照組HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞可見(jiàn)Bax低表達(dá),與對(duì)照組比較,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L組Bax表達(dá)顯著增加(p0.05)。對(duì)照組HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞可見(jiàn)Bcl-2高表達(dá),與對(duì)照組比較,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L組Bax表達(dá)顯著減少(p0.05)。上述結(jié)果表明,PTL通過(guò)以濃度依賴(lài)方式增加HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞Bax的表達(dá),降低Bcl-2的表達(dá),誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡。5、MTT法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用(1)VCR對(duì)結(jié)腸癌HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞株有增殖抑制作用(p0.05),并呈濃度依賴(lài)關(guān)系(p0.05),VCR半數(shù)抑制濃度IC50分別為2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR對(duì)VCR的耐藥指數(shù)為17.6倍。(2)VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞無(wú)顯著增殖抑制作用(p0.05),VCR 6、10μg/ml對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞有輕度增殖抑制作用(p0.05),PTL5μmol/L與VCR(0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml)聯(lián)用可顯著增加VCR對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞的增殖抑制作用(p0.05)。聯(lián)用后VCR IC50為3.01±0.45μg/ml,與VCR單獨(dú)應(yīng)用時(shí)比較,IC50顯著降低(p0.05),PTL可顯著降低HCT-8/VCR對(duì)VCR的耐藥指數(shù)(p0.05)。上訴結(jié)果說(shuō)明,PTL可顯著增加顯著增加VCR對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞的增殖抑制作用,逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR的耐藥。6、流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞凋亡率5.01%±0.47%,經(jīng)VCR2μg/ml處理24h后,HCT-8/VCR細(xì)胞的凋亡率為6.93%±1.45%,與對(duì)照組比較,無(wú)顯著差異(p0.05),經(jīng)PTL5μmol/L處理24h后,HCT-8/VCR細(xì)胞的凋亡率為10.02%±0.86%,與對(duì)照組比較,凋亡率顯著增加(p0.05),PTL5μmol/L+VCR2μg/ml處理24h的HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡率為34.7%±2.33%,與VCR2μg/ml組及PTL5μmol/L組比較,凋亡率均顯著性增加(p0.05)。結(jié)果表明,PTL可顯著增加VCR誘導(dǎo)HCT-8/VCR細(xì)胞凋亡能力,逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)VCR的耐藥。7、Western-blot法檢測(cè)PTL對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表達(dá)的影響。western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示,HCT-8對(duì)照組可見(jiàn)P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表達(dá);與HCT-8對(duì)照組比較,HCT-8/VCR對(duì)照組P-gp、MRP、GST-π蛋白表達(dá)顯著增加(p0.05);與HCT-8對(duì)照組比較,HCT-8/VCR對(duì)照組PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理HCT-8/VCR細(xì)胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表達(dá)顯著減少(p0.05),且PTL濃度越大蛋白表達(dá)越低。8、隨著大黃素濃度的逐漸提高,CACO-2細(xì)胞生存率逐漸降低,至200μmol/L,細(xì)胞生存率幾乎接近0。而大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞培養(yǎng)24h的IC 50值為30μmol/L。9、隨著大黃素濃度的逐漸升高,CACO-2細(xì)胞凋亡率也隨之升高,從對(duì)照組的1.85%,升至60μmol/L大黃素組的42.66%。大黃素對(duì)CACO-2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)。10、30μmol/L和60μmol/L的大黃素干預(yù)后,細(xì)胞核明顯濃縮,染色加深,偶見(jiàn)核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊。尤其是60μmol/L的大黃素干預(yù)后,凋亡細(xì)胞核碎裂成大小不等的圓形小體,并被細(xì)胞膜所包繞,疑似凋亡小體。11、對(duì)照組細(xì)胞大部分處于G0/G1期,為62.3%,處于S期33.7%,處于G2/M期4.0%;大黃素干預(yù)后,細(xì)胞周期在G2/M期明顯發(fā)生停滯,該期細(xì)胞數(shù)顯著增多。并且隨著大黃素濃度的提高,停滯于G2/M期的細(xì)胞也逐漸增多。以60μmol/L的大黃素組G2/M細(xì)胞周期阻滯最為明顯。12、對(duì)照組細(xì)胞Bax呈低水平表達(dá),而隨著大黃素濃度的增高,表達(dá)水平逐漸上調(diào);Bcl-2表達(dá)水平與Bax正好相反,對(duì)照組細(xì)胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表達(dá),隨著大黃素濃度的增高,表達(dá)水平逐漸下調(diào)。而非磷酸化PI3K、AKT表達(dá)水平各組間無(wú)明顯差異。結(jié)論:1、小白菊內(nèi)酯對(duì)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用,小白菊內(nèi)酯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用不受HCT-8/VCR細(xì)胞耐藥性的影響,小白菊內(nèi)酯可通過(guò)增加Bax的表達(dá),降低Bcl-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。2、小白菊內(nèi)酯可顯著增加VCR對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞的增殖抑制能力及凋亡誘導(dǎo)能力,小白菊內(nèi)酯對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。其機(jī)制主要是通過(guò)PTL降低HCT-8/VCR細(xì)胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表達(dá),逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR細(xì)胞的耐藥性。3、大黃素對(duì)CACO-2結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。其抗癌作用主要是由于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。此外,它還能抑制CACO-2細(xì)胞的PI3/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián),提示大黃素在結(jié)腸癌治療中的潛在應(yīng)用。
【圖文】：

PTL 對(duì) HCT-8 細(xì)胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)，PTL 對(duì) HCT-8 細(xì)胞增殖抑間依賴(lài)關(guān)系。表 2 PTL 對(duì) HCT-8/VCR 細(xì)胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)別 HCT-8/VCR（增殖抑制率%）μmol/L） 12h 24h 48h對(duì)照） 0.00 士 0.00 0.00 士 0. 00 0.00 士 05 12.84 士 2.11* 16.5 士 2.66* 28.80 士 210 26.37 士 1.87* 36.56 士 3.04* 46.22 士 215 40.13 士 2.96* 41.36 士 4.26* 58.45 士 420 46.43 士 3.45* 62.22 士 4.35* 75.51 士 240 67.75 士 1.66* 73.61 士 2.57* 83.72 士 2

TL 對(duì) HCT-8/VCR 細(xì)胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)，PTL 對(duì) HCT-8 細(xì)間依賴(lài)關(guān)系。 HCT-8、HCT-8/VCR 細(xì)胞凋亡的影響。胞儀檢測(cè) PTL5μmol/L, 10μmol/L, 20μmol/L 對(duì) HCT-8、HCT，統(tǒng)計(jì)凋亡率，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次，結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示， HCT-8 細(xì)胞凋亡率 4.23%±0.75%，，與對(duì)照組比較，經(jīng) 5、10 24h 后，HCT-8 細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p<0.05)，分別為 8.75% ， 38.16%±3.25% ， 見(jiàn) 圖 3 。 對(duì) 照 組 HCT-8/VCR 細(xì)6%，與對(duì)照組比較，經(jīng) 5、10、20μmol/L 的 PTL 處理 24h 后亡率顯著增加(p<0.05)，分別為 8.43%±0.95%，21.651%，見(jiàn)圖 4。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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8 郭雙;;試論化濁解毒中藥血清及補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的影響[J];中醫(yī)臨床研究;2015年15期

9 劉海曄;;中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的研究進(jìn)展[J];中草藥;2015年07期

10 趙瑾;李興德;何文志;高敬華;李永生;李際君;史英;柳志寶;;奧氮平聯(lián)合醋酸甲地孕酮治療晚期癌癥性厭食癥的療效觀察[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2015年10期

本文編號(hào)：2596596