【摘要】：目的本研究通過運(yùn)用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法建立慢性腦缺血損傷的大鼠模型,觀察精制清開靈對模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及對海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響,從行為學(xué)和組織形態(tài)學(xué)做出初步藥效評價(jià)。在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)研究精制清開靈對模型大鼠海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及受體TrkB、神經(jīng)生長因子NGF、神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3表達(dá)的影響,以期部分闡明精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用機(jī)制。方法(1)采用對實(shí)驗(yàn)大鼠永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法制作慢性腦缺血大鼠模型。實(shí)驗(yàn)動物分為正常組(Sham)、模型組(Model)、多奈哌齊組(Donepezi)、精制清開靈組(RQKL)。大鼠造模后給予藥物連續(xù)灌胃60天。通過Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn),對各組進(jìn)行定位航行和空間探索測試,實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5天。水迷宮測試結(jié)束后,隨機(jī)抽取各組的部分實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行灌注固定取材,制成腦組織海馬石蠟切片,進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化。(2)采用免疫組化方法、免疫印跡分析方法測定海馬CA1 區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白表達(dá)變化,用Real Time PCR方法測定BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達(dá)變化,分析精制清開靈對BDNF、TrkB的表達(dá)影響。(3)運(yùn)用免疫組化方法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測定海馬CA1區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3、神經(jīng)生長因子NGF蛋白表達(dá),用Real Time PCR方法測定NGFmRNA、NT-3 mRNA的表達(dá)變化,分析精制清開靈對NT-3、NGF的表達(dá)影響。結(jié)果(1)慢性腦缺血模型大鼠在進(jìn)行永久雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后出現(xiàn)一些行為學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的病態(tài)改變。在水迷宮測試中,慢性腦缺血模型大鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。與Sham組大鼠相比,Model組大鼠逃避潛伏期的降低趨勢比較平緩,逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(P0.05);Model組大鼠穿越平臺次數(shù)及穿越原平臺象限次數(shù)均顯著減少(P0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)HE染色可見Model組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較Sham組明顯減少,錐體細(xì)胞排列松散紊亂,胞體縮小,細(xì)胞核固縮或溶解,細(xì)胞間距變大,少部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫,呈現(xiàn)出一些較明顯的缺血性病理改變。(2)精制清開靈藥物連續(xù)灌胃60天后,經(jīng)水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Model組大鼠相比,RQKL組大鼠逃避潛伏期下降趨勢較明顯,逃避潛伏時(shí)間明顯縮短(P0.05);空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Model組大鼠相比,RQKL組大鼠穿越平臺次數(shù)及穿越原平臺象限次數(shù)均明顯上升(P0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)HE染色可見RQKL組大鼠神經(jīng)元數(shù)量較Model組增多,神經(jīng)細(xì)胞丟失減少,細(xì)胞排列較為有序,細(xì)胞邊界較清晰,固縮現(xiàn)象減少,細(xì)胞數(shù)和形態(tài)接近Sham組。(3)精制清開靈干預(yù)下海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白水平及BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達(dá)均有明顯變化。采用免疫組化方法測定顯示,與Model組相比,RQKL組BDNF、TrkB在海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞棕黃色陽性表達(dá)均明顯增多(分別為0.48±0.06,P0.05;0.39±0.05,P0.05)。采用免疫印跡分析法測定結(jié)果顯示,與Model組相比,RQKL組BDNF、TrkB蛋白含量均明顯提高(分別為0.49±0.07,P0.05;0.41±0.09,P0.01)。運(yùn)用RT-PCR法檢測結(jié)果顯示,與Model組相比,RQKL組BDNFmRNA、TrkBmRNA表達(dá)水平明顯升高(分別為0.79±0.10,P0.05;0.71±0.04,P0.05)。(4)精制清開靈干預(yù)下海馬CA1區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3、神經(jīng)生長因子NGF蛋白含量及NT-3mRNA、NGFmRNA的表達(dá)均有明顯改變。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Model組相比,RQKL組神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3、神經(jīng)生長因子NGF在海馬CA1區(qū)的陽性細(xì)胞表達(dá)均有上升(分別為0.58±0.04,P0.01;0.33±0.04,P0.05)。采用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測結(jié)果顯示,與Model組相比,RQKL組海馬中NT-3、NGF蛋白含量明顯增多(分別為157.24±16.58,P0.01;122.05±14.34,P0.05)。運(yùn)用Real Time PCR法檢測結(jié)果顯示,與Model組相比,RQKL組NT-3mRNA、NGFmRNA表達(dá)水平明顯升高(分別為1.35±0.11,P0.01;0.84±0.08 P0.05)。結(jié)論(1)精制清開靈可在一定程度上改善慢性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力,減輕慢性腦缺血引起的大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。(2)精制清開靈可上調(diào)海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白水平及mRNA的表達(dá),說明其促進(jìn)BDNF及其受體TrkB的有效結(jié)合,從而發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用,有可能是精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用途徑之一。(3)精制清開靈可上調(diào)海馬CA1區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3、神經(jīng)生長因子NGF蛋白水平及mRNA的表達(dá),在一定程度上發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用,有可能是精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用途徑之一。
【圖文】：

圖１－１定位航行實(shí)驗(yàn)各組大鼠逃避潛伏期趨勢圖（秒）（Ｘ土ｓ，邋ｎ＝１５）逡逑

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本文編號：2589032