【摘要】：肉蓯蓉(Cistanches Herba)為名貴中藥,有較高的藥用和食用價(jià)值,被譽(yù)為“沙漠人參”。近年來(lái),針對(duì)肉蓯蓉的化學(xué)成分定性、定量研究不斷深入,但主要集中于苯乙醇苷類化學(xué)成分研究上,尚未見對(duì)其大極性和中、小極性成分的同步定性、定量分析的報(bào)道。苯乙醇苷類化合物為肉蓯蓉中主要活性成分,結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)不穩(wěn)定基團(tuán),易在分析過(guò)程中降解而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此,需要建立可靠的分析手段對(duì)肉蓯蓉進(jìn)行精確質(zhì)量分析。以肉蓯蓉總苷為原料的蓯蓉總苷膠囊在臨床中廣泛應(yīng)用于髓海不足證造成的輕、中度血管性癡呆,但體內(nèi)藥效物質(zhì)及作用機(jī)理尚未明確。因此,本論文針對(duì)以上研究缺陷,對(duì)肉蓯蓉的體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究,并利用藥物代謝組學(xué)方法探索肉蓯蓉抗血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質(zhì)和作用機(jī)制,以期提高肉蓯蓉質(zhì)量分析方法,為肉蓯蓉的臨床應(yīng)用及相關(guān)藥物的開發(fā)提供參考。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.肉蓯蓉化學(xué)成分的全面定性定量分析建立加壓溶劑提取模塊(PLE),實(shí)現(xiàn)肉蓯蓉樣品快速微量(約1mg)提取,通過(guò)LC-IT-TOF-MS分析肉蓯蓉超聲提取和加壓溶劑提取方法的提取效率,驗(yàn)證了加壓溶劑提取模塊能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)成分的高效提取。利用IT-TOF-MS高分辨質(zhì)譜豐富的多級(jí)質(zhì)譜信息,系統(tǒng)總結(jié)了肉蓯蓉主要成分苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,并鑒定肉蓯蓉中79個(gè)化學(xué)成分。同時(shí),將加壓溶劑提取模塊與高效液相色譜在線連接,構(gòu)建PLE-TFC-HPLC-DAD系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了肉蓯蓉中8個(gè)苯乙醇苷類成分的快速同步定量分析,方法學(xué)考察結(jié)果顯示該方法能夠?qū)崿F(xiàn)肉蓯蓉的快速、準(zhǔn)確定量。PLE系統(tǒng)的建立和應(yīng)用,減少了分析過(guò)程中樣品和有機(jī)溶劑的用量,節(jié)約了制備樣品的時(shí)間,降低了不穩(wěn)定成分在處理過(guò)程中降解的可能性,實(shí)現(xiàn)了肉蓯蓉樣品直接、快速的在線分析,同時(shí)也為中藥和生物樣品等固體復(fù)雜基質(zhì)的分析提供了可靠、快速的綠色分析方法。為闡明肉蓯蓉體內(nèi)代謝物,首先對(duì)肉蓯蓉化學(xué)成分組進(jìn)行深入解析。采用Qtrap-MS質(zhì)譜的多種掃描模式,如預(yù)測(cè)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(pMRM)、中性丟失掃描(NL)、母離子掃描(Prec)、增強(qiáng)子離子掃描(EPI)和增強(qiáng)質(zhì)譜掃描(EMS)等,利用高分辨質(zhì)譜研究的質(zhì)譜裂解規(guī)律,建立基于特征碎片的NL162Da、146Da等中性丟失掃描方法和Prec m/z 161、m/z 145等母離子掃描方法,對(duì)苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類等主要化學(xué)類型進(jìn)行深度挖掘,并基于HMDB等數(shù)據(jù)庫(kù)建立pMRM方法檢測(cè)初級(jí)代謝產(chǎn)物。綜上,共檢測(cè)到肉蓯蓉中513個(gè)化學(xué)成分,基本闡明了肉蓯蓉化學(xué)成分組。采用反相色譜-親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(RPLC-HILIC-MS/MS)對(duì)肉蓯蓉中的大、中和小極性27個(gè)成分,如氨基酸、核苷、苯乙醇苷、糖類等,進(jìn)行了同步定量分析。利用在線質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化策略對(duì)肉蓯蓉中含量高的松果菊苷、毛蕊花糖苷、甘露糖醇質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行選擇性抑制,并采用高靈敏度的sMRM模式保證低含量化學(xué)成分的檢出。方法學(xué)考察結(jié)果表明該系統(tǒng)能夠擴(kuò)展檢測(cè)線性范圍、增強(qiáng)對(duì)極性化合物的保留,適用于肉蓯蓉中極性跨度大、含量差異大的多成分同步含量測(cè)定,也為其他中藥的多成分全面質(zhì)量控制提供可靠的方法。2.肉蓯蓉的體內(nèi)化學(xué)成分分析基于亞結(jié)構(gòu)拆分和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化策略,采用LC-MS技術(shù)對(duì)酪醇、羥基酪醇、咖啡酸、紅景天苷、肉蓯蓉苷F、脫羧基迷迭香酸、毛蕊花糖苷、松果菊苷以及肉蓯蓉的體內(nèi)代謝過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)研究。發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷、苯丙素苷以及含酯鍵的化合物灌胃大鼠后酯鍵和苷鍵發(fā)生斷裂,易在體內(nèi)發(fā)生水解反應(yīng),充分闡明了肉蓯蓉的體內(nèi)代謝產(chǎn)物是主要是苯乙醇苷類降解產(chǎn)物羥基酪醇(HT)、咖啡酸(CA)、高香草酸(HVA)、阿魏酸、3-羥基苯丙酸(3-HPP)等,以磺酸化形式進(jìn)入血液,經(jīng)尿液排泄。通過(guò)各單體化合物以及肉蓯蓉體內(nèi)代謝物組的系統(tǒng)分析,單體和肉蓯蓉血漿中的代謝物體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間不同,單體化合物的體內(nèi)代謝過(guò)程并不能代表中藥復(fù)雜成分的體內(nèi)真實(shí)代謝過(guò)程。本論文從單體到總提物的體內(nèi)過(guò)程系統(tǒng)研究,提供了豐富的肉蓯蓉代謝物組信息,也為中藥體內(nèi)代謝研究提供新思路。3.基于藥物代謝組學(xué)的肉蓯蓉抗血管性癡呆研究建立了雙側(cè)頸總動(dòng)脈(2VO)結(jié)扎所致的大鼠血管性癡呆模型,通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以及病理切片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷提取物(CG)給藥后能夠減輕2VO所致的海馬神經(jīng)元的損傷,并顯著改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。建立基于LC-MS技術(shù)的藥物代謝組學(xué)方法,并研究了肉蓯蓉對(duì)血管性癡呆大鼠血漿代謝物組(metabolome)的影響。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明給藥組和模型組之間以及模型組與假手術(shù)組之間血漿內(nèi)源性代謝物水平存在差異,并初步鑒定了39個(gè)血管性癡呆相關(guān)差異代謝物。與模型組大鼠相比,CG給藥組顯著調(diào)節(jié)了26個(gè)內(nèi)源性代謝物。進(jìn)一步分析差異代謝物涉及的代謝通路,發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉給藥后的HT、HVA、3-HPP等主要代謝產(chǎn)物,能夠直接參與芳香族氨基酸代謝,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝通路,從而參與調(diào)節(jié)血管性癡呆的神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂。同時(shí),甘油磷脂代謝以及花生四烯酸代謝等通路也受到調(diào)節(jié)。因此,肉蓯蓉可能通過(guò)其代謝產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝,改善脂質(zhì)代謝紊亂、抗氧化損傷、促進(jìn)抗炎反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗血管性癡呆作用。通過(guò)對(duì)HT、HVA等潛在藥效物質(zhì)的活性驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其都能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷,從而發(fā)揮對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用,進(jìn)一步說(shuō)明肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物為肉蓯蓉抗血管性癡呆的主要藥效物質(zhì)。綜上所述,本論文建立了肉蓯蓉的全成分定性、定量分析方法,闡明了肉蓯蓉的化學(xué)成分組,系統(tǒng)研究了肉蓯蓉的體內(nèi)代謝產(chǎn)物,初步闡明了肉蓯蓉抗血管性癡呆的藥效物質(zhì)為苯乙醇苷類化合物的體內(nèi)降解產(chǎn)物,肉蓯蓉可能通過(guò)代謝產(chǎn)物直接參與神經(jīng)遞質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多途徑發(fā)揮抗血管性癡呆的藥效。
【圖文】：

蓉防治血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質(zhì)及可能的作用機(jī)制，為肉蓯蓉通過(guò)“補(bǔ)精益髓”理論逡逑治療神經(jīng)退行性疾病提供依據(jù)。逡逑具體研宄路線如圖５所示。本研究以ＬＣ邋ＭＳ為主要技術(shù)手段，建立肉蓯蓉體內(nèi)外逡逑化學(xué)成分的定性定量方法，，闡明肉蓯蓉化學(xué)物質(zhì)組以及代謝物組，基于藥物代謝組學(xué)方逡逑法和體外活性驗(yàn)證，系統(tǒng)研究肉蓯蓉防治血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質(zhì)及可能的作用機(jī)逡逑制。本研宄的開展同時(shí)也為基于代謝組學(xué)的中藥藥效物質(zhì)研究提供有效參考，為中藥體逡逑內(nèi)外成分的全面分析以及藥效物質(zhì)研究提供思路和方法。逡逑產(chǎn)建立在線加壓提取方法；邐產(chǎn)ＩＴ－ＴＯＦ－ＭＳ分析；逡逑，建立ＲＰＬＣ／ＨＩＬＩＣ方法；邐，Ｑ邋Ｅｘａｃｔｉｖｅ－ＭＳ分析；逡逑產(chǎn)建立ＲＰＬＣ－ＨＩＬＩＣ系統(tǒng)邐，Ｑｔｒａｐ－ＭＳ分析逡逑大鼠血漿、尿液、逡逑１邐１邐糞便、膽汁逡逑定性分析邐定量分析逡逑體內(nèi)代謝逡逑產(chǎn)物鑒定逡逑＂邐裂解規(guī)律總結(jié)逡逑構(gòu)建化學(xué)成分組邐構(gòu)建體內(nèi)代謝物組逡逑２Ｖ0大鼠模型一：ＩＳ片逡逑體外活性驗(yàn)證邐藥物代謝組學(xué)逡逑ｒ多元統(tǒng)計(jì)分析；逡逑，Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ邋＜＾１軟件；逡逑

提取溶劑以２．５邋ｍＬ／ｍｉｎ流速進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)，產(chǎn)生提取所需的反壓（約１３．０邋ＭＰａ），從而逡逑實(shí)現(xiàn)加壓溶劑微提取。將整個(gè)提取模塊連接于進(jìn)樣器后面，并置于柱溫箱中給予一定溫逡逑度（７０°Ｃ），降低水的極性和粘度，提高提取效率。具體裝置及工作原理示意圖見圖６。逡逑２９逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5;R284


本文編號(hào)：2588041