本文關鍵詞：貧鈾暴露對腎臟和免疫系統(tǒng)的影響及鋅的解毒作用研究

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【摘要】：研究背景和目的 貧鈾(depleted uranium，DU)是天然鈾經(jīng)過提煉濃縮鈾(~(235)U)之后的剩余產(chǎn)物，其~(235)U含量低于0.712％。由于DU具有良好的穿透性和原料的廉價性，被廣泛地用于核電站、平衡錘、輻射防護及軍事活動中(如作為裝甲材料及彈藥成分)。在DU的生產(chǎn)和使用過程中，可能會不規(guī)范地釋放到環(huán)境中，經(jīng)呼吸道、消化道或皮膚進入體內(nèi)，對周圍居民的健康造成嚴重地威脅。 DU可發(fā)射高線性能量轉移的α、β粒子，既具有放射毒性，又具有重金屬毒性，其生物學影響與接觸劑量、持續(xù)時間、接觸途徑等多種因素有關。在大劑量急性暴露的條件下，腎臟是鈾急性化學毒性的主要靶器官，可造成嚴重的腎近曲小管壞死，然而，DU引起腎臟毒性的準確機制還不清楚。在低劑量慢性暴露的情況下，可能會引起一系列有害的效應，如神經(jīng)行為的異常、生殖毒性、遺傳毒性和癌癥等，然而，普遍關注的問題——長期攝入DU污染的食物對免疫系統(tǒng)的影響，目前還沒有報道。因此，本研究分別建立DU急性暴露模型和經(jīng)過食入途徑的慢性暴露模型，分別評價急性DU暴露對腎臟的影響和慢性DU暴露對免疫系統(tǒng)的影響，深入探索急慢性DU暴露的作用機制，為DU生物學效應的研究打下基礎。 此外，針對DU中毒的救治，仍是國內(nèi)外研究的重點和難點�，F(xiàn)有的DU促排藥在促排效果或安全性方面都或多或少存在問題。金屬硫蛋白(metallothinein, MT)是一類廣泛存在于哺乳動物器官和組織中的低分子量非酶蛋白，富含半胱氨酸，對重金屬離子有很高的親和力，并能清除多種自由基，可實現(xiàn)對金屬的解毒，但其解毒機制仍不完全清楚。MT基因的表達，需要二價鋅離子的參與，鋅屬于高效且安全的MT誘導劑。因此，可試圖通過鋅誘導機體產(chǎn)生MT來實現(xiàn)DU的解毒治療，為臨床上開發(fā)高效低毒的DU解毒藥物提供新的思路，具有重要的實用價值和現(xiàn)實意義。 研究方法 首先分別利用人腎臟近曲小管上皮HK-2細胞和成年Sprague Dawley大鼠，暴露于不同劑量的DU，造成DU急性染毒模型，分別觀察暴露于DU后24h對細胞存活率、凋亡及相關酶活力的影響，以及暴露于DU后4d對大鼠腎臟鈾含量、腎功能、組織病理學及腎臟組織抗氧化水平的影響。 其次，3周齡昆明系小鼠，按照喂食飼料(含DU)劑量的不同分為4組：0(對照組)，3(DU3組)，30(DU_(30)組)，和300(DU_(300)組)mg/kg，喂食長達4個月，造成DU慢性染毒模型，評價小鼠天然免疫和獲得性免疫功能的變化。 最后，分別利用HK-2細胞、Sprague Dawley大鼠和MT基因敲除小鼠，進行鋅對DU中毒的解毒作用及機制的研究，通過組織形態(tài)學、細胞超微病理學、流式細胞術、激光共聚焦顯微鏡技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、分子生物學及蛋白組學等技術方法多角度評價鋅對DU的解毒作用，深入探索鋅對DU的解毒機制。 研究結果及結論 1.高于125μM的DU(硝酸鈾酰)暴露后24h，均可引起HK-2細胞質膜和溶酶體膜的破壞，而導致乳酸脫氫酶(LDH)和N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG)從細胞內(nèi)釋放到培養(yǎng)液中，最終導致細胞的凋亡。另外，將Sprague Dawley大鼠急性暴露于不同劑量的DU(2.5、5、10mg/kg)，4d后觀察發(fā)現(xiàn)，大于2.5mg/kg的DU暴露劑量均可引起明顯的腎臟毒性，導致腎臟組織鈾含量、血清尿素(BUN)和肌酐(Cr)均明顯增高，組織病理學損傷嚴重，且隨著DU暴露劑量的增高損傷逐漸加重。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DU引起了腎臟組織氧化應激，導致抗氧化能力下降，脂質過氧化水平增高，可能是導致DU腎臟毒性的機制之一。 2.3周齡小鼠喂食不同劑量的含DU飼料4個月后，各組血生化檢查均無明顯異常。在中劑量組(30mg/kg)和低劑量組(3mg/kg)，免疫學影響并不明顯或影響相對輕微。但在高劑量組(300mg/kg)，小鼠的天然免疫功能下降，表現(xiàn)為腹腔巨噬細胞分泌的NO、IL-1、IL-18、TNF-α水平降低，脾臟自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells)的細胞毒性作用降低；小鼠的細胞免疫和體液免疫功能異常，表現(xiàn)為脾臟T細胞增殖能力下降而B細胞的增殖能力提高，血清總IgG、IgE的含量增高，遲發(fā)性超敏反應實驗顯示足跖增厚程度下降；流式細胞術實驗發(fā)現(xiàn)脾臟mIgM+mIgD+雙陽性細胞比例增高，CD3+細胞比例降低，CD4+/CD8+脾臟T細胞的比值降低；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，脾細胞經(jīng)過刺激后，釋放IFN-γ和TNF-α的水平降低，而釋放IL-4和IL-10的水平卻增高。以上結果提示，，造成高劑量組小鼠免疫功能障礙的原因主要與體內(nèi)輔助T細胞(Th)1/Th2細胞因子平衡紊亂，引起機體各項免疫功能的調(diào)節(jié)失常有關。 3.線粒體調(diào)節(jié)的凋亡途徑和FasR調(diào)節(jié)的凋亡途徑共同參與了DU引起的HK-2細胞的凋亡過程。而100μM鋅預處理可明顯抑制DU(500μM)引起的HK-2凋亡，通過降低細胞內(nèi)活性氧的生成，增加過氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量，抑制DU引起的sFasR和sFasL的過表達，抑制線粒體中的細胞色素c和凋亡誘導因子(AIF)釋放到胞漿，抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活以及促進了金屬硫蛋白的表達。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，外源性金屬硫蛋白也具有很好的抗DU引起的凋亡的作用。本研究結果證實了，鋅通過一些獨立的機制抑制了DU引起的凋亡，包括抗氧化效應、抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活，并且金屬硫蛋白可能參與了鋅抗DU引起的凋亡過程。 4.鋅預處理(10mg/kg)對急性DU中毒(10mg/kg)具有明顯的解毒作用，明顯提高了大鼠暴露于DU后30d的存活率，使暴露于DU4d后的尿鈾含量增加，肝、脾、腎鈾含量降低，血清BUN、Cr及尿液NAG顯著降低，并使血清IL-6和TNF-α、腎臟組織金屬硫蛋白MT-1、MT-2的基因表達水平明顯增高，CAT含量增高，丙二醛(MDA)含量降低，病理學損傷減輕。進一步使用鋅預處理MT-/-小鼠和MT+/+小鼠，發(fā)現(xiàn)MT+/+小鼠的鈾含量明顯降低，且腎臟損傷明顯減輕，抗氧化能力增強；但鋅預處理對MT-/-小鼠卻沒有明顯的DU解毒效果。外源性MT的不同基因型(MT1和MT2)對DU解毒效果的研究發(fā)現(xiàn)，MT1和MT2均可降低MT-/-小鼠腎臟的鈾含量，且MT-1可使腎臟的病理損傷明顯減輕，抗氧化能力增強，而MT2的保護效果卻并不明顯。因此，鋅的解毒作用與誘導MT的合成有關，一方面，MT可促進DU的排出；另一方面，MT可增強體內(nèi)的抗氧化能力，拮抗DU對組織的損傷，并且MT1的作用更加明顯。 5. MT-/-小鼠和MT+/+小鼠暴露于DU后，利用蛋白組學方法對小鼠腎臟組織蛋白的改變進行研究，發(fā)現(xiàn)有13個差異表達蛋白，它們的主要功能集中在糖和脂肪酸的代謝、電子傳遞呼吸鏈以及抗氧化防御系統(tǒng)等方面。進一步分析發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶(SOD)、氨基�；�-3(ACY-3)在暴露于DU后明顯降低，且MT-/-小鼠降低更為明顯，提示了這些蛋白可能參與了DU引起的腎臟中毒過程。采用免疫印跡技術對典型的差異蛋白SOD和ACY-3的表達量進行驗證，所得結果與蛋白組學研究結果相吻合，再次驗證了貧鈾腎毒性的機制之一是引起氧化應激，并且ACY-3可能是DU發(fā)揮腎毒性的新的靶點，而MT可通過調(diào)節(jié)它們的含量在一定程度上減輕腎臟損傷。
【關鍵詞】：貧鈾 免疫功能 鋅 金屬硫蛋白 凋亡
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R82
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• Abstract8-12
• 摘要12-15
• 第一章 前言15-20
• 1.1 選題緣由15-16
• 1.2 研究背景16-18
• 1.3 研究意義18
• 1.4 研究內(nèi)容18-19
• 1.5 研究方法19-20
• 第二章 急性貧鈾暴露對腎臟的影響20-37
• 2.1 急性貧鈾暴露對 HK-2 細胞的影響20-28
• 2.1.1 材料和方法20-24
• 2.1.2 結果24-27
• 2.1.3 討論27-28
• 2.2 大劑量貧鈾急性暴露對大鼠腎臟影響28-37
• 2.2.1 材料和方法28-32
• 2.2.2 結果32-35
• 2.2.3 討論35-37
• 第三章 慢性貧鈾暴露對免疫系統(tǒng)的影響37-54
• 3.1 材料和方法38-43
• 3.2 結果43-49
• 3.3 討論49-54
• 第四章 鋅對貧鈾中毒的解毒效果及其機制研究54-120
• 4.1 鋅對貧鈾引起的 HK-2 細胞凋亡的影響55-72
• 4.1.1 材料和方法56-60
• 4.1.2 結果60-70
• 4.1.3 討論70-72
• 4.2 鋅對急性貧鈾中毒大鼠的解毒效果及機制初探72-85
• 4.2.1 材料和方法72-77
• 4.2.2 結果77-82
• 4.2.3 討論82-85
• 4.3 金屬硫蛋白抗貧鈾引起的腎臟毒性的機制初探85-102
• 4.3.1 材料和方法86-91
• 4.3.2 結果91-100
• 4.3.3 討論100-102
• 4.4 金屬硫蛋白抗貧鈾腎臟毒性的蛋白組學研究102-120
• 4.4.1 材料和方法103-109
• 4.4.2 結果109-116
• 4.4.3 討論116-120
• 全文總結120-122
• 一、主要結論120
• 二、本研究的主要創(chuàng)新點120-121
• 三、問題與展望121-122
• 參考文獻122-140
• 文獻綜述一 貧鈾損傷的生物學效應研究進展140-149
• 參考文獻146-149
• 文獻綜述二 鈾的急性腎臟毒性及其救治方法研究進展149-161
• 參考文獻154-161
• 攻讀學位期間的研究成果161-162
• 致謝162

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