本文關鍵詞：人GDF-15的克隆、表達條件優(yōu)化及藥理活性的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:對人生長分化因子-15(human growth differentiation factor-15,hGDF-15)成熟肽基因進行克隆,誘導hGDF-15蛋白表達并對部分表達條件進行優(yōu)化,對建模成功的動物模型注射hGDF-15蛋白觀察其作用,為hGDF-15藥理活性和生物學功能的研究奠定基礎。方法:利用PCR技術克隆人GDF-15成熟肽基因,將其連接到pET-28a載體上構建pET-28a-hGDF-15原核表達載體;在此基礎上將其轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)大腸桿菌感受態(tài),獲得重組大腸桿菌,分別采用不同溫度(16,25,37℃)、不同IPTG濃度(0.1,0.25,0.5,0.75,1mmol/L)和不同時間(12,24,36,48 h)對其進行誘導表達,對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳,利用Gel Quant Express軟件對菌體破碎離心的上清組分和沉淀組分進行含量測定,設計正交試驗,分析上清組分和沉淀組分最適誘導表達條件;選用DAB顯色法對誘導出的蛋白樣品進行Western blot鑒定,利用Ni-Agarose親和柱對表達產(chǎn)物進行純化,設置不同濃度的GuNTA(20,40,60,100,500 mmol/L咪唑)洗脫純化出hGDF-15蛋白,并將純化后獲得hGDF-15蛋白凍干;對實驗組動物C57BL/6型小鼠喂養(yǎng)高脂飼料(80%基礎飼料,10%豬油,10%蛋黃粉),對照組喂養(yǎng)基礎飼料,將體重合格的實驗組小鼠注射STZ(100 mg/kg),誘導其成為胰島素抵抗動物模型,通過皮下給藥方式注射hGDF-15蛋白對其進行治療,觀察用藥后的血糖變化。結果:成功獲得hGDF-15成熟肽基因(339bp);構建了pET-28a-hGDF-15原核表達載體;成功誘導出hGDF-15蛋白;根據(jù)正交試驗優(yōu)化出上清組分最適誘導條件為IPTG濃度為0.25 mmol/L、溫度為16℃、時間為24 h,沉淀組分最適誘導條件為溫度為37℃、時間為36 h、IPTG濃度為1 mmol/L,最高表達量為95.2mg/L;經(jīng)Western blot鑒定表達產(chǎn)物為hGDF-15蛋白,100mmol/L咪唑的GuNTA成功洗脫出目的蛋白,凍干后經(jīng)計算純化后的回收率為29.8%;成功建立高脂胰島素抵抗C57BL/6小鼠模型,并證明hGDF-15具有一定治療糖尿病和胰島素抵抗的作用。結論:成功克隆hGDF-15基因并在大腸桿菌中誘導表達出該蛋白,優(yōu)化出最適誘導條件,純化并獲得該蛋白,利用該蛋白對高脂胰島素抵抗動物模型進行治療,具有一定的效果,這為該蛋白的功能研究提供了實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：生長分化因子-15 原核表達 表達條件優(yōu)化 高脂動物模型 糖尿病
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96;Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9
• 第一篇 文獻綜述9-16
• 1.1 糖尿病9-10
• 1.2 生長分化因子-1510-14
• 1.2.1 hGDF-15的發(fā)現(xiàn)10
• 1.2.2 hGDF-15的基因分子結構和表達調(diào)控10-12
• 1.2.3 hGDF-15的信號通路12
• 1.2.4 hGDF-15與代謝疾病12-13
• 1.2.5 hGDF-15與糖尿病13
• 1.2.6 hGDF-15其他領域中的研究13-14
• 1.3 糖尿病動物模型14
• 1.4 研究的目的和意義14-16
• 第二篇 研究內(nèi)容16-62
• 第一章 人GDF-15的克隆及重組質(zhì)粒的構建16-36
• 1.1 材料16-19
• 1.1.1 質(zhì)粒載體與工程菌16
• 1.1.2 主要試劑16-17
• 1.1.3 主要儀器17-18
• 1.1.4 公司服務18
• 1.1.5 主要試劑配制18-19
• 1.2 方法19-25
• 1.2.1 hGDF-15成熟肽基因引物設計19
• 1.2.2 hGDF-15成熟肽基因的克隆19-21
• 1.2.3 重組pET-28a-h GDF-15 原核表達載體的構建及鑒定21-25
• 1.2.4 hGDF-15基因序列及生物信息學分析25
• 1.3 結果與分析25-33
• 1.3.1 hGDF-15成熟肽基因的克隆25
• 1.3.2 重組pET-28a-hGDF-15表達載體的鑒定25-26
• 1.3.3 hGDF-15基因序列及生物信息學分析26-33
• 1.4 討論33-34
• 1.5 小結34-36
• 第二章 人GDF-15蛋白的表達及表達條件優(yōu)化36-48
• 2.1 材料36-38
• 2.1.1 實驗材料36
• 2.1.2 主要試劑36
• 2.1.3 主要儀器36-37
• 2.1.4 主要試劑配制37-38
• 2.2 方法38-40
• 2.2.1 hGDF-15蛋白的誘導表達38
• 2.2.2 hGDF-15蛋白的SDS-PAGE電泳38-39
• 2.2.3 hGDF-15蛋白含量分析及表達條件的優(yōu)化39-40
• 2.3 結果與分析40-46
• 2.3.1 hGDF-15蛋白誘導表達結果40-44
• 2.3.2 hGDF-15蛋白含量分析及表達條件的優(yōu)化44-46
• 2.4 討論46-47
• 2.5 小結47-48
• 第三章 人GDF-15蛋白的鑒定和純化48-55
• 3.1 材料48-49
• 3.1.1 實驗材料48
• 3.1.2 主要試劑48
• 3.1.3 主要儀器48
• 3.1.4 主要試劑配制48-49
• 3.2 方法49-51
• 3.2.1 Western blot鑒定49-50
• 3.2.2 hGDF-15蛋白純化50-51
• 3.3 結果與分析51-53
• 3.3.1 Western blot鑒定結果51-52
• 3.3.2 hGDF-15蛋白純化結果52
• 3.3.3 hGDF-15凍干結果52-53
• 3.4 討論53-54
• 3.5 小結54-55
• 第四章 Ⅱ糖尿病動物模型的建立及人GDF-15蛋白藥理活性初步研究55-62
• 4.1 材料55-56
• 4.1.1 實驗材料55
• 4.1.2 主要試劑55
• 4.1.3 主要儀器55
• 4.1.4 主要試劑配制55-56
• 4.2 方法56-57
• 4.2.1 高脂動物模型建立方法56
• 4.2.2 Ⅱ型糖尿病模型建立方法56
• 4.2.3 hGDF-15藥理活性56-57
• 4.3 結果與分析57-60
• 4.3.1 實驗小鼠一般指標57-58
• 4.3.2 高脂組血糖變化58-59
• 4.3.3 hGDF-15藥理活性結果59-60
• 4.4 討論60-61
• 4.5 小結61-62
• 結論62-63
• 參考文獻63-68
• 作者簡介68-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 曹玉珍;張秀英;;高脂飼料誘發(fā)C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪肝相關指標的動態(tài)觀察[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2011年03期

2 陳夢華;凌宏艷;周壽紅;王光;李興;胡弼;;檳榔堿上調(diào)高果糖誘導胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT-4和p-PI3K的表達[J];中南醫(yī)學科學雜志;2012年01期

3 李瑞峰,魏樹珍,李莉,邴魯軍,陳融,郭成浩;Wistar大鼠2型糖尿病模型的建立[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2002年04期

4 李永進;陳媛媛;畢利軍;;融合標簽技術及其應用[J];生物工程學報;2006年04期

5 扎迦利;劉海霞;;美國內(nèi)分泌學會關于糖尿病前期的會議共識(二)[J];糖尿病天地(臨床);2009年09期

  本文關鍵詞：人GDF-15的克隆、表達條件優(yōu)化及藥理活性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304544