本文關(guān)鍵詞：蛇毒抗補體蛋白CVF的試劑化制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究蛇毒抗補體蛋白CVF試劑化冷凍干燥的工藝,凍干制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及將其用于制備內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)-相關(guān)纖溶凝血分子變化模型的研究。方法:將眼鏡蛇毒粗毒通過陽離子交換層析、分子篩、陰離子交換層析分離純化,獲得CVF;通過堿性電泳及等電聚膠、高效液相色譜、飛行質(zhì)譜進(jìn)行純度、分子量的鑒定;將純化的CVF進(jìn)行冷凍干燥的制劑研究,研究不同蛋白濃度(0.200、0.500、1.000mg/m L)、不同保護(hù)劑(單一保護(hù)劑:蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、BSA;復(fù)合保護(hù)劑:甘露醇分別與蔗糖、乳糖、海藻糖復(fù)配)、不同p H值(6.0、6.8、7.4)對CVF冷凍干燥的影響。在上述研究的基礎(chǔ)上,初步確定合適的配方,進(jìn)行穩(wěn)定性試驗:將CVF凍干樣品在不同溫度(6、25、37°C)下分別放置1、2、3Month后對純度、蛋白回收率及活性進(jìn)行檢測;通過上述研究擬訂出CVF冷凍干燥的制備工藝及相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。然后采用CVF特異激活血清補體旁路途徑,刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),通過ELISA檢測多個時間點細(xì)胞培養(yǎng)上清中P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM及NO指標(biāo)水平的變化,并進(jìn)一步研究吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜蘆醇對以上指標(biāo)變化的干預(yù)作用。結(jié)果:眼鏡蛇毒粗毒通過陽離子交換層析、分子篩、陰離子交換層析分離制備的CVF在堿性電泳及等電聚膠下均為一條帶,飛行質(zhì)譜分析得到其分子量為144.7KD;CVF的冷凍干燥研究表明,凍干過程中CVF的蛋白回收率和活性的保留量與CVF的濃度呈正相關(guān);使用單一保護(hù)劑的結(jié)果表明,蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇對三種濃度CVF冷凍干燥中的蛋白量回收率及活性保留量均有保護(hù)作用,且甘露醇對活性保護(hù)的效果略優(yōu)于其他三個配方;三個濃度下;BSA對中低濃度的CVF的活性具有保護(hù)作用,且與正常組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01);甘露醇分別與海藻糖、蔗糖、乳糖復(fù)配對冷凍干燥中CVF的蛋白回收率及活性保留量均有保護(hù)作用,在高濃度時,三個組別的蛋白量與正常組相比,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),三者間無顯著差異;p H值為7.4時,三個濃度下CVF的蛋白回收率及活性保留量均高于p H值為6.0、6.8時CVF的蛋白量及活性;穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,CVF于6、25、37°C條件下放置1、2、3Mon時,甘露醇與海藻糖復(fù)合配方組對CVF有較好的保護(hù)作用。其中,不同條件下CVF的蛋白回收率無明顯變化;6°C條件下放置1-3 Mon時甘露醇與蔗糖配方的CVF活性幾乎無損失;25°C條件下,隨著放置時間增加其活性略有降低;37°C條件下放置時,其活性降低,在3 Mon時尤為明顯。根據(jù)上述CVF的分離純化、冷凍干燥、純度檢測、蛋白回收率測定、活性測定的研究,初步確定了CVF試劑化制備工藝的小試條件及相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);在CVF特異激活微血管內(nèi)皮細(xì)胞致炎癥反應(yīng)的模型中,P-selectin、VWF的表達(dá)快速上調(diào),其高峰時間為15min,而纖溶功能分子t-PA、PAI-1也隨后出現(xiàn)持續(xù)上調(diào)表達(dá),與凝血功能相關(guān)的組織因子TF表達(dá)水平持續(xù)上調(diào),而血栓蛋白TM及NO的表達(dá)下降;吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜蘆醇對P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上調(diào)表達(dá)具有抑制作用,而對TM及NO表達(dá)水平的下調(diào)具有干預(yù)作用。結(jié)論:通過本研究初步建立了切實可行的CVF試劑化制備的小試工藝,穩(wěn)定性好,可控制性強,并初步擬定了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),能為CVF的進(jìn)一步應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和參考。采用CVF特異激活補體旁路刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞,會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)的變化,白藜蘆醇對此變化具有干預(yù)作用。以上研究,這能為新藥的篩選和研發(fā)提供合適的細(xì)胞模型和參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：補體 CVF 補體旁路活化 冷凍干燥 內(nèi)皮細(xì)胞 纖溶 凝血
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 第一章 蛋白質(zhì)冷凍干燥的研究進(jìn)展8-15
• 1 冷凍干燥概述8
• 2 冷凍干燥的應(yīng)用8-9
• 2.1 食品工業(yè)8
• 2.2 醫(yī)療工業(yè)8-9
• 2.3 菌種保藏9
• 2.4 其他9
• 3 蛋白質(zhì)冷凍干燥的損傷機(jī)理9-10
• 4 蛋白質(zhì)冷凍干燥中的影響因素10-11
• 4.1 溫度10
• 4.2 濃度效應(yīng)10-11
• 4.3 p H值11
• 4.4 相分離11
• 5 蛋白冷凍干燥中的保護(hù)機(jī)理及保護(hù)劑11-13
• 5.1 保護(hù)機(jī)理11-12
• 5.2 蛋白質(zhì)冷凍干燥中的保護(hù)劑12-13
• 5.2.1 糖和多羥基類12-13
• 5.2.2 氨基酸13
• 5.2.3 聚合物13
• 6 結(jié)語與展望13-15
• 第二章 蛇毒抗補體蛋白CVF的冷凍干燥工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究15-47
• 1 實驗材料17-18
• 1.1 試劑和材料17
• 1.2 實驗動物17
• 1.3 主要儀器17-18
• 1.4 主要溶液的配制18
• 2 實驗方法18-23
• 2.1 CVF的分離純化18-19
• 2.2 純度及分子量鑒定19-20
• 2.3 CVF的冷凍干燥20-23
• 2.4 蛋白定量23
• 2.5 CVF的活性測定23
• 2.6 相對抗補體活力的計算23
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析23
• 3 實驗結(jié)果23-44
• 3.1 CVF的分離純化24-26
• 3.2 純度鑒定26-28
• 3.3 CVF的冷凍干燥28-44
• 4、討論44-47
• CVF試劑化制備的實驗室小試工藝（草案）47-49
• CVF凍干制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（草案）49-52
• 第三章 CVF激活補體旁路致內(nèi)皮細(xì)胞纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)變化及干預(yù)研究52-67
• 1. 實驗材料53-56
• 1.1 主要試劑53
• 1.2 主要儀器53-54
• 1.3 細(xì)胞株54
• 1.4 眼鏡蛇毒因子54
• 1.5 主要溶液的配制54-55
• 1.6 人血清制備55
• 1.7 人血清補體活性檢測55-56
• 2、實驗方法56-58
• 2.1 CAC對HMEC凝血纖溶相關(guān)蛋白分子表達(dá)的影響56-57
• 2.2 PDTC、Res對CAC刺激HMEC表達(dá)纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)變化的影響57-58
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析58
• 3、實驗結(jié)果58-65
• 3.1 CAC對HMEC纖溶凝血相關(guān)分子表達(dá)的影響58-61
• 3.2 PDTC和Res對HMEC凝血纖溶相關(guān)分子表達(dá)變化的干預(yù)作用61-65
• 4 討論65-67
• 第四章 結(jié)論67-68
• 致謝168-69
• 致謝269-70
• 參考文獻(xiàn)70-79
• 附錄一79-80
• 附錄二80-82

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉占杰,華澤釗;蛋白質(zhì)藥品冷凍干燥過程中變性機(jī)理的研究進(jìn)展[J];中國生化藥物雜志;2000年05期

  本文關(guān)鍵詞：蛇毒抗補體蛋白CVF的試劑化制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：286879