發(fā)布時(shí)間：2017-06-02 02:09

  本文關(guān)鍵詞：不同力學(xué)因素作用下人源MG-63成骨樣細(xì)胞差異基因表達(dá)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞,在新骨形成和舊骨吸收的穩(wěn)態(tài)平衡中具有十分重要的意義。適當(dāng)應(yīng)力刺激作用于成骨細(xì)胞后可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部,促使成骨細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子,從而影響成骨細(xì)胞生物學(xué)功能。目前已證實(shí),流體剪切應(yīng)力是成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞在生理狀態(tài)下感受到的主要機(jī)械應(yīng)力刺激。此外,重力作為一種場(chǎng)力,也可影響成骨細(xì)胞的功能。在航天飛行中的失重環(huán)境可導(dǎo)致航天員出現(xiàn)骨質(zhì)丟失,主要原因就是失重所導(dǎo)致的成骨細(xì)胞功能下降,骨形成能力降低。目前,應(yīng)力和重力刺激對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究多集中在某個(gè)或者某些已知與成骨細(xì)胞功能密切相關(guān)的分子物質(zhì),但基因水平的變化機(jī)制尚不明確�；蛐酒夹g(shù)將探針分子密集固定于支持物表面后與預(yù)先標(biāo)記熒光染料的樣品(蛋白質(zhì)、cDNA等)進(jìn)行雜交,通過測(cè)量探針的熒光強(qiáng)度從而獲得樣品的表達(dá)情況和序列信息。因此,利用基因芯片研究應(yīng)力和重力等力學(xué)因素調(diào)控成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的分子類型,對(duì)探索失重性骨質(zhì)丟失的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,尋找對(duì)抗失重性骨質(zhì)丟失的分子靶點(diǎn),開發(fā)新型對(duì)抗措施具有重要意義。本課題針對(duì)流體剪切應(yīng)力和重力兩種力學(xué)因素作用下成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化開展研究工作。通過基因芯片技術(shù),分別檢測(cè)了流體剪切應(yīng)力作用后人源mg-63成骨樣細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化,回轉(zhuǎn)器模擬失重后mg-63細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化,并選擇在兩種應(yīng)力變化下均顯著差異表達(dá)的基因esm1,進(jìn)一步探討了esm1對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:一、流體剪切應(yīng)力作用后mg-63細(xì)胞差異基因研究mg-63細(xì)胞以適當(dāng)密度(1×105個(gè)/孔)接種于載玻片(25.5×21.5mm),于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細(xì)胞隨機(jī)分為剪切應(yīng)力組和正常對(duì)照組。剪切應(yīng)力組移至流體剪切系統(tǒng)中給予符合在體生理范圍的流體剪切應(yīng)力刺激(1.5pa,60min)。正常對(duì)照組細(xì)胞給予除流體剪切應(yīng)力作用外的相同處理。處理結(jié)束后分別提取兩組總rna,對(duì)rna進(jìn)行質(zhì)檢,合格后進(jìn)行affymetrix基因芯片雜交掃描,并對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。經(jīng)過芯片掃描,發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力組與正常對(duì)照組相比,有6223個(gè)基因發(fā)生了改變,其中表達(dá)上調(diào)基因2554個(gè),表達(dá)下調(diào)基因3669個(gè)。geneontology注釋分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)響應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控和細(xì)胞增殖等功能調(diào)控。pathway富集注釋分析還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與了mapk信號(hào)通路、tgf-β信號(hào)通路、p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、focaladhesion信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)調(diào)控。在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)最大的各10個(gè)差異基因中,15個(gè)基因尚未見在成骨細(xì)胞中開展過研究報(bào)道。二、模擬失重后mg-63細(xì)胞差異基因研究mg-63細(xì)胞以適當(dāng)密度(1×105個(gè)/孔)接種于載玻片(25.5×21.5mm),于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細(xì)胞隨機(jī)分為模擬失重組和正常對(duì)照組。模擬失重組置于2d-rwvs型雙向多樣本回轉(zhuǎn)器中回轉(zhuǎn),回轉(zhuǎn)速度24rpm,作用時(shí)間48h。正常對(duì)照組細(xì)胞在回轉(zhuǎn)艙中靜置相同時(shí)間。處理結(jié)束后分別提取兩組的總rna,質(zhì)檢合格后進(jìn)行affymetrix基因芯片雜交掃描,并對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析�；蛐酒瑨呙杞Y(jié)果發(fā)現(xiàn),模擬失重組與正常對(duì)照組相比,197個(gè)基因發(fā)生了改變,其中表達(dá)上調(diào)基因151個(gè),表達(dá)下調(diào)基因46個(gè)。geneontology注釋分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)上調(diào)基因主要參與細(xì)胞生物合成進(jìn)程的負(fù)性調(diào)控和細(xì)胞死亡的調(diào)控等功能調(diào)控。表達(dá)下調(diào)基因主要參與細(xì)胞骨架聯(lián)接、細(xì)胞大分子物質(zhì)代謝等細(xì)胞組分和功能調(diào)控。差異表達(dá)基因翻譯蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn),fos、fosb、stat3和hbegf等差異表達(dá)基因的蛋白產(chǎn)物與其他差異表達(dá)基因蛋白產(chǎn)物相互作用關(guān)系緊密。在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)最大的各10個(gè)差異基因中,13個(gè)基因尚未見在成骨細(xì)胞中開展過研究報(bào)道。三、模擬失重后差異表達(dá)基因esm1對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響流體剪切應(yīng)力和模擬失重后的基因芯片結(jié)果中,均顯示esm1發(fā)生顯著性差異性表達(dá)。為此,我們對(duì)esm1在成骨細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用進(jìn)行了驗(yàn)證性研究。首先,使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)驗(yàn)證回轉(zhuǎn)器模擬失重后mg-63細(xì)胞中esm1基因的表達(dá)變化;其次,通過轉(zhuǎn)染sirna抑制esm1基因表達(dá),觀察mg-63細(xì)胞增殖、分化、礦化能力的變化。結(jié)果證實(shí),在模擬失重后esm1的基因表達(dá)顯著上調(diào)。通過轉(zhuǎn)染sirna沉默esm1表達(dá)后,mg-63細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng),表明esm1對(duì)mg-63細(xì)胞的增殖有負(fù)性調(diào)控作用;抑制esm1表達(dá)后,mg-63細(xì)胞分化標(biāo)志物alp、runx2表達(dá)量顯著下降,表明esm1對(duì)mg-63細(xì)胞的分化有正性調(diào)控作用;抑制esm1表達(dá)后,茜素紅染色表明細(xì)胞礦化能力顯著增強(qiáng),表明esm1對(duì)mg-63細(xì)胞的礦化有負(fù)性調(diào)控作用。綜上所述,流體剪切應(yīng)力和模擬失重作用后人源mg-63成骨樣細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變。差異表達(dá)基因廣泛參與細(xì)胞的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)途徑和信號(hào)通路調(diào)控。同時(shí),在高倍數(shù)差異表達(dá)的基因中,較多基因在成骨細(xì)胞功能調(diào)控中的作用尚不明確。本研究的成果,為開展力學(xué)因素調(diào)控成骨細(xì)胞功能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究提供了大量有意義的分子靶點(diǎn),其中esm1的初步研究結(jié)果證實(shí)了可以通過生物信息學(xué)的方法選擇出合適的研究靶點(diǎn)。通過對(duì)這些差異基因開展進(jìn)一步的研究,將對(duì)闡明力學(xué)因素作用下成骨細(xì)胞生物學(xué)功能改變的分子機(jī)制,尋找對(duì)抗失重性骨質(zhì)丟失的分子靶點(diǎn),開發(fā)新型對(duì)抗措施具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：力學(xué)因素 基因芯片 MG-63細(xì)胞 流體剪切應(yīng)力 模擬失重
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R852.2
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-24
• 第一部分 剪切應(yīng)力作用下MG-63細(xì)胞基因差異表達(dá)的研究24-87
• 1 材料24-26
• 2 方法26-30
• 3 結(jié)果30-84
• 4 討論84-87
• 第二部分 模擬失重后MG-63細(xì)胞基因差異表達(dá)的研究87-113
• 1 材料87-88
• 2 方法88
• 3 結(jié)果88-110
• 4 討論110-113
• 第三部分 ESM1對(duì)MG-63細(xì)胞增殖、分化、礦化能力的影響113-123
• 1 材料113-114
• 2 方法114-117
• 3 結(jié)果117-121
• 4 討論121-123
• 小結(jié)123-124
• 參考文獻(xiàn)124-134
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果134-135
• 致謝135-136

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