發(fā)布時間：2020-08-21 05:24

【摘要】：研究背景和目的:力學刺激同生物化學刺激均在細胞內(nèi)觸發(fā)各種胞內(nèi)信號。目前,力學生物學成為研究流體靜水壓、壓縮應力和拉伸應力等力學刺激對生物體影響的重要手段之一。力學刺激在骨重塑中起著重要作用。骨組織細胞在體內(nèi)的應力作用下分化、增殖并成熟,并對應力刺激極為敏感。體外培養(yǎng)的工程骨組織往往不能提供足夠的組織結構和力學性能,這在很大程度上歸因于細胞培養(yǎng)過程中缺乏力學載荷的刺激。近幾十年來,我國在航空航天領域取得了巨大的成就,空間探索、科研活動、飛行訓練活動日益頻繁,重力場(微重力、超重)的改變對骨組織代謝影響的研究也越來越受到關注。由于細胞質(zhì)和細胞內(nèi)的細胞器,如細胞核、線粒體、細胞骨架(包括肌動蛋白纖維、中間絲和微管)等均有不同的密度,重力的改變可引起它們相對位置的改變。研究表明,重力場的變化對細胞的結構和功能均產(chǎn)生各種影響。一般來說,微重力的暴露可抑制骨質(zhì)的生成。雖然超重可以通過體外高速離心的方式實現(xiàn),但目前為止,關于高重力(高G)環(huán)境對骨組織細胞影響的相關研究卻相當有限。最新的研究表明,超重可觸發(fā)復雜的力學傳導途徑,在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生重要的調(diào)節(jié)作用。然而,超重對成骨細胞影響的確切力學生物學機制還有待深入研究。本文主要采用力學生物學方法探討高重力(超重)的極端力學環(huán)境下成骨細胞如何響應,分子水平如何變化,成骨細胞損傷、重建的過程和機理如何,為極端力學環(huán)境下骨組織細胞的生長、分化、重建和適應性變化的研究提供理論基礎。該研究是對生理載荷環(huán)境下骨組織/細胞的生長、分化、重建和適應性變化研究工作的延伸,從而發(fā)展生物力學和力學生物學的新理論、新方法和新技術,拓展生物力學研究的新領域。研究方法:1高加速度離心式加載裝置構建小鼠MC3T3-E1細胞高重力模型,加速度分別為1 g、5 g、10 g、20 g、40 g,1天1次,每次30 min,共3天;2小鼠MC3T3-E1細胞經(jīng)高重力暴露后,應用HE染色、透射電鏡及鬼筆環(huán)肽染色分別觀察MC3T3-E1細胞形態(tài)、超微結構及細胞微絲骨架的變化;3小鼠MC3T3-E1細胞經(jīng)高重力暴露后,應用Edu細胞增殖實驗、Annexin V-FITC/PI流式細胞術分別檢測高重力對MC3T3-E1細胞增殖和凋亡的影響;qPCR及western blot檢測高重力對小鼠MC3T3-E1細胞成骨相關基因及蛋白的表達及活性的影響;4采用小鼠lncRNA表達譜及mRNA表達譜芯片篩選差異表達基因及共同差異LncRNA及mRNA表達基因,構建高重力環(huán)境下影響成骨細胞基因表達調(diào)控圖,篩選最相關的信號通路和信號分子,進一步研究候選基因的功能及其調(diào)控機制;5運用串聯(lián)質(zhì)譜標簽(Tandem Mass Tag,TMT)標記的蛋白組學定量技術、聯(lián)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析,研究高重力加載前后MC3T3-E1細胞蛋白質(zhì)表達譜的變化,篩選差異表達的蛋白,力學生物學及分子生物學方法進一步研究重點蛋白質(zhì)的功能;多組學聯(lián)合關聯(lián)分析轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達等多方面信息,深入探討高重力在骨重建中的作用及其作用機制。結果:1小鼠MC3T3-E1細胞在正常1 g環(huán)境下,培養(yǎng)早期,細胞以梭形為主,細胞突起明顯,細胞與細胞之間通過突起相連接,主要呈現(xiàn)成纖維細胞類型;培育晚期,細胞以立方形為主,細胞與細胞之間連接成片,排列成鋪路石狀,主要呈現(xiàn)上皮細胞類型。小鼠MC3T3-E1細胞在高重力環(huán)境下,隨著重力加速度的不斷增加(5 g、10 g、20 g、40 g)以及培養(yǎng)時間的逐漸增長(24 h、48 h、72 h),小鼠MC3T3-E1細胞輪廓逐漸變圓;細胞內(nèi)部微絲肌動蛋白纖維增粗,細胞體積增大,輪廓變圓,與光鏡下結果一致;細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核及其線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細胞超微結構均發(fā)生改變。2高重力的極端力學環(huán)境下,小鼠MC3T3-E1細胞的生物學功能發(fā)生改變。低水平(5 g)的高重力暴露,小鼠MC3T3-E1細胞增殖活性開始升高;中水平(10g和20 g)的高重力暴露,成骨細胞增殖活性顯著升高;高水平的(40 g)高重力暴露,成骨細胞的增殖活性則受到抑制。低水平(5 g)的高重力刺激對成骨細胞凋亡無明顯作用;中水平(10 g和20 g)的高重力刺激可引起成骨細胞輕度凋亡;高水平(40 g)的高重力刺激,對成骨細胞造成損害,引起成骨細胞的大量凋亡。低、中水平(5 g、10 g和20 g)的高重力刺激均能促進小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表達,其中,當重力加速度為10 g和20 g時,促分化作用最為明顯。高水平(40 g)的高重力刺激下,小鼠成骨基因(Runx2、ALP和OCN)mRNA和蛋白的表達下降。3芯片共檢測了58,809小鼠lncRNAs和39,027小鼠mRNAs,超重環(huán)境下,大量的lncRNA和mRNA均發(fā)生改變,且隨著重力加速度的增加,差異表達的lncRNA和mRNA也越來越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差異表達的lncRNAs有193個,mRNAs有35個,其中上調(diào)的有28個lncRNAs和6個mRNAs,下調(diào)的有165個lncRNAs和29個mRNAs。通過生物信息學分析了潛在的調(diào)控機制并進一步預測了差異表達的lncRNAs和mRNAs之間的相互作用關系,通過mRNAs-lncRNAs共表達網(wǎng)絡分析鑒定了超重環(huán)境中參與骨重建的核心調(diào)控因子。結合表達譜芯片檢測以及生物信息學分析結果,將lncRNA NONMMUT012703確定為高重力敏感、骨重建相關的lncRNA目標分子進行功能學研究。4通過TMT相對定量的蛋白質(zhì)組學研究,發(fā)現(xiàn)超重環(huán)境下,大量蛋白發(fā)生變化。隨著重力加速度的增加,差異表達的蛋白也越來越多。在低(5 g)、中(10 g和20 g)、高(40 g)水平高重力暴露下,共差異表達的蛋白有24個,其中上調(diào)的有22個,下調(diào)的有2個。通過生物信息學分析了潛在的調(diào)控機制并預測了差異表達蛋白之間的互作關系,進一步研究重點蛋白質(zhì)的功能。5針對非編碼RNA(lncRNAs)表達譜、編碼RNA(mRNAs)表達譜和蛋白表達譜,多組學聯(lián)合關聯(lián)分析轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達等多方面信息,深入探討高重力在骨重建中的作用及其機制。生物信息學及后續(xù)的相關研究結果預測,NONMMUT012703作為高重力敏感、骨重建相關的候選lncRNA,可能與靶基因(如CFTR,NFATC2,SYCN,SOCS3,GIP,SNHG7OS和VMN2R90)相互作用,或與轉(zhuǎn)錄因子(c-Rel、HNF-3beta、E47、HLF、RFX1和COMP1)結合,通過多條信號通路(如MAPK、Jak-STAT、cGMP-PKG、Wnt、PI3K-Ak和VEGF信號通路等)之間的串話作用,共同參與超重環(huán)境下的骨重建過程。結論:1課題組自主研發(fā)的高加速度離心式加載裝置可良好的模擬超重環(huán)境,適用于超重環(huán)境下細胞力學生物學效應的研究。2小鼠MC3T3-E1細胞具有成骨細胞的生物學特性,力學刺激下具有良好的生物學響應,是研究力學作用下成骨細胞生物學效應的良好模型。3成骨細胞在高重力環(huán)境下,為對抗力學刺激,細胞形態(tài)、微絲骨架及超微結構均發(fā)生改變。4高重力的極端力學環(huán)境對成骨細胞的生物學功能產(chǎn)生很大的影響。超重對成骨細胞增殖、凋亡和分化的影響取決于重力加速度的大小。重力加速度20 g以下為細胞安全加載范圍,不會引起成骨細胞的大量凋亡。中水平(10 g和20 g)的高G刺激,小鼠成骨細胞生物學行為變化最為顯著。5高重力的極端力學環(huán)境下,小鼠MC3T3-E1細胞的非編碼RNA(lncRNAs)譜、編碼RNA(mRNAs)譜及蛋白的表達譜均發(fā)生改變,且隨著重力加速度的增加,差異變化的基因和蛋白也逐漸增多。6重力場變化情況下獲得的在成骨分化過程中具有差異表達的lncRNA可能是骨組織損傷、修復與重建過程中的潛在靶標。7成骨細胞受到超重暴露后差異表達的蛋白可能是重力敏感、骨重建相關的生物標志蛋白。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R85
【圖文】：

圖 1-1 骨的結構與力學適應性長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過 200個核苷酸（nt）的 RNA，不具有長可讀框且無編碼蛋白功能。在不同的組織之間lncRNA 表達量不同，且同一組織在不同生長階段 lncRNA 表達量也存在差異[24]。lncRNA 與 mRNA 作為轉(zhuǎn)錄本，有很多相似之處，他們均在 RNA 聚合酶Ⅱ的作用下進行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后可進行剪切，并且 3′端有 poly(A)尾巴的結構。與 mRNA 相比，lncRNA 在不同物種間保守性更差，表達水平也更低。從發(fā)現(xiàn)之初，不具有生物學功能的“轉(zhuǎn)錄噪音”到現(xiàn)在的“明星分子”，大量的研究表明，lncRNA 在正常細胞功能維持和疾病發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要作用。例如：有研究顯示定位于失活 X 染色體的 lncRNAXist 包被將要失活的 X 染色體，并招募多梳抑制復合體 2 移行至 X 染色體失活中心，在 X 染色體失活過程中發(fā)揮了重要作用[26]，這一研究提供了第 1 個直接的證據(jù)，揭示了與蛋白質(zhì)調(diào)控方式不同，lncRNAs 可以利用它們的基因組信息（包括環(huán)境和位置）來發(fā)揮作用，將靶標集合到一起；還有l(wèi)ncRNA-LALR1 能夠招募 CTCF 至 Axin1 啟動子區(qū)域從而抑制 Axin1 的表達，進而激活 Wnt/β-Catenin 信號通路，促進 Cyclin D1 表達，從而促進肝癌細胞增殖[27]；

圖 1-2 lncRNA 調(diào)控機制在骨組織工程、臨床與基礎研究領域，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些 lncRNA 可通過影響多種因子的表達，調(diào)控骨組織細胞功能，參與骨相關疾病的病理過程。新近的研究表明，成骨形成過程中 H19 表達顯著上調(diào)[30]。另一研究顯示，lncRNA DANCR 可招募多梳抑制復合體 EZH2，通過調(diào)控后者與成骨調(diào)節(jié)基因 Runx2 啟動子的結合，抑制成骨形成[31]。敲除人牙周膜干細胞的 DANCR 基因，可激活細胞β-catenin/Wnt信號傳導通路，并促進成骨細胞形成[32]。組蛋白去乙�；福⊿IRT1）作為一個重要的正向調(diào)節(jié)骨量和成骨形成的因子，其對 lncRNA HIF1A-AS1 發(fā)揮調(diào)控成骨功能至關重要。研究顯示，過表達 SIRT1 后，HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表達顯著減少，而基因敲除或藥理學阻斷 SIRT1 后 HBMSCs 的 HIF1A-AS1 表達顯著增加[33]。誘導多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化過程中，MEG3 高表達。正常成骨細胞靶向敲除 MEG3 后，BMP4 的表達顯著降低，成骨細胞分化功能受到抑制。外源性加入 BMP4 或異位 MEG3 過表達可用以治療多發(fā)性骨髓瘤患者的MSCs 成骨缺損[34]。微陣列分析人骨髓 MSC 與體外誘導培養(yǎng) 2 周的軟骨細胞lncRNA 時，發(fā)現(xiàn) 3000 多 lncRNA 表達具有顯著差異，其中 3 個 lncRNA

軍事科學院博士學位論文用。該技術運用 10 種同位素的標簽，將多肽的氨基基團進行標記，通過HPLC-MS/MS 分析技術，同時比較 10 組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。相對于其他蛋白定量技術，其檢測靈敏度高，低豐度蛋白也可被檢測；檢測范圍廣，幾乎任何物種的各類蛋白質(zhì)均可被分離鑒定；檢測通量高，10 組不同樣本中蛋白質(zhì)的相對含量可被同時鑒定分析；檢測效能高，通過氨基標記反應，標記率高，液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好，目前該技術已在很多對比分析實驗中得到了驗證。蛋白質(zhì)組學技術作為一種高通量、高靈敏度的方法與基因芯片一并成為后基因組時代生命科學研究的重要技術，是“功能蛋白質(zhì)組學”和“功能基因組學”的有力研究手段。采用這兩種實驗技術構建lncRNA-mRNA 和靶蛋白的網(wǎng)絡關系，將特異 lncRNA、蛋白機制作用研究與網(wǎng)絡研究相結合，極有可能找到高 G 環(huán)境下骨重建的有效力學作用靶點。

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本文編號：2798984