【摘要】：核泄漏事件、日常放療造成的醫(yī)源性放射損傷和制造業(yè)的輻射消毒等使人類暴露在放射性射線的危險性大大提高。放射性皮膚損傷是放射治療中最常見的并發(fā)癥,是指放療過程中各種放射性元素對放療區(qū)域皮膚組織造成的肉眼可見的病損,常見的放射性元素包括X線、γ射線、質子、粒子以及電子等各類電離輻射。放射性皮膚損傷的發(fā)生率很高,若不采取保護措施,約90%的放療患者會出現(xiàn)局部皮膚紅斑,嚴重者會發(fā)生皮膚脫落和潰瘍,嚴重影響患者生活質量。真皮和結締組織中主要細胞組成為成纖維細胞(Fibroblasts, Fb),它在創(chuàng)面修復過程發(fā)揮主導作用。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是脂肪來源的具有多種分化潛能的干細胞。它取材方便、能向多種細胞分化并且能分泌多種細胞因子來修復損傷。ADSCs與放射損傷的修復關系密切,可能通過自分泌和誘導效應細胞旁分泌多種細胞因子修復放射損傷。何種細胞因子通過何種途徑參與這種修復過程尚未明確。磷脂酰肌醇 3 激酶-蛋白激酶 B (phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-PKB,也稱 PI3K-Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在放射損傷中的調控作用在多項研究中得到證實,近年來已明確部分長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, LncRNA)在放射領域扮演重要角色,部分LncRNA與PI3K-Akt通路發(fā)生相互作用也受到關注。ADSCs在放射損傷修復中通過何種信號通路發(fā)揮作用,LncRNA是否參與其修復機制目前尚未明確�；谝陨峡紤],本課題擬通過高通量測序和基因沉默技術對ADSCs修復放射性損傷機制進行研究。第一部分ADSCs和Fb原代培養(yǎng)、共培養(yǎng)模型的建立以及ADSCs對Fb放射損傷后的影響目的:原代提取ADSCs和Fb,建立共培養(yǎng)模型研究ADSCs的干預對放射損傷成纖維細胞增殖、凋亡以及細胞周期的影響。方法:用酶消化法從大鼠腹股溝脂肪和真皮組織中原代提取ADSCs和Fb,通過流式細胞技術、多向誘導分化以及免疫細胞化學進行鑒定。用0.4μmTranswell共培養(yǎng)板建立非接觸式共培養(yǎng)模型,建模成功后實驗分為4組,Fb1組為成纖維細胞對照組,F2組為8Gy X射線照射的成纖維細胞組,Fb3組為ADSCs干預的8GyX射線照射的成纖維細胞組,NRK組為NRK細胞干預的8GyX射線照射的成纖維細胞組(陰性對照)。CCK-8法檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測凋亡和周期變化。結果:酶消化法能提取較高純度原代細胞,經鑒定提取的ADSCs可向成骨、成脂肪誘導分化,ADSCs表面標志物CD29、CD44、CD31和CD45陽性率達標,成纖維細胞高表達波形蛋白Vimentin。Fb2組經8Gy放射損傷的成纖維細胞較Fb1對照組增殖能力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05),Fb3組ADSCs共培養(yǎng)干預后的成纖維細胞增殖能力較Fb2組顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。Fb2組較Fb1對照組凋亡顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05) , Fb3組ADSCs共培養(yǎng)干預后的成纖維細胞凋亡較Fb2組顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。8Gy照射后Fb2組成纖維細胞周期阻滯在G2期,ADSCs干預后Fb3組細胞周期較Fb2組由G2/M向G1/S進展,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:成纖維細胞在接受了 8Gy X射線放照射后細胞增殖活力減弱、凋亡增加、周期阻滯在G2期。當我們進行了 ADSCs的共培養(yǎng)干預后成纖維細胞增殖活力增強、凋亡減少、細胞周期進程加快。第二部分ADSCs對大鼠放射性皮膚損傷的影響目的:研究ADSCs在大鼠放射性皮膚損傷模型體內的存活情況以及對大鼠放射性皮膚損傷導致的凋亡的影響。方法:改良RifkinLH皮膚放射模型,實驗分為5組,空白對照組、單純照射組、ADSCs靜脈注射組、ADSCs局部注射組和PBS局部注射組。照射采用背部2cm×2cm區(qū)域接受20Gy照射,ADSCs注射量為2×106,Luciferase和GFP雙標慢病毒轉染標記。不同時間點用小動物活體成像系統(tǒng)觀察ADSCs在體內存活情況,取材進行冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察,制作石蠟切片行Tunnel凋亡染色。結果:ADSCs靜脈注射組出現(xiàn)肺攔截,24h左右活體成像顯示熒光消失,ADSCs局部注射組至少在注射后15天內仍然能夠檢測到熒光。單純照射組較空白對照組凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ADSCs局部注射組較單純照射組凋亡顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ADSCs靜脈注射組較單純照射組凋亡降低(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。結論:2×106 ADSCs局部注射在經20Gy照射的大鼠背部皮膚可以至少存活15天,ADSCs可以減輕放射性皮膚損傷導致的凋亡。第三部分ADSCs對Fb放射性損傷干預的高通量mRNA/LncRNA測序、蛋白質譜檢測以及驗證目的:ADSCs共培養(yǎng)干預放射損傷的成纖維細胞,篩查基因和蛋白水平的差異表達,預測可能發(fā)揮作用的信號通路并進行驗證。方法:實驗分為空白對照Fb組、8Gy照射后的Fb2組以及經ADSCs共培養(yǎng)干預后的Fb3組。采用高通量mRNA/LncRNA測序和蛋白質譜檢測篩選出差異基因和蛋白,測序和蛋白質譜聯(lián)合分析可能作用的信號通路,篩查LncRNA并預測靶基因。結果:8Gy照射后的Fb2組較空白對照組P53通路發(fā)生明顯上調。經ADSCs共培養(yǎng)干預后的Fb3組較單純8Gy照射的Fb2組PI3K-Akt和MAPK通路顯著上調。Real time-PCR和Western-blot驗證與以上通路相關的凋亡和周期分子,Fb2 vs Fb1上調的有 P53、P21、P27、CyclinB、Bax 以及 CleavedCaspase-3,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);下調的有CyclinD1、Bcl-2,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Fb3vs Fb2上調的有CyclinD1、Bcl-2和c-myc,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);下調的有 CyclinB、Bax、CleavedCaspase-3、P21 和 P27,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。從篩查出的40條LncRNA結合Real time-PCR驗證,鎖定變化最顯著的4條,分別是 LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034 和 LNC_001030。結論:8Gy X線照射后的成纖維細胞可能通過P53通路上調介導放射損傷,ADSCs可能通過PI3K-Akt和MAPK通路激活使成纖維細胞發(fā)生修復。LNC_000473、ENSRNOT00000076586、LNC_001034 和 LNC_001030 可能在 ADSCs修復成纖維細胞放射損傷中扮演重要角色。第四部分ADSCs修復成纖維細胞放射性損傷的機制研究目的:檢測共培養(yǎng)上清液中差異表達的細胞因子,用篩查出的細胞因子干預放射損傷成纖維細胞后研究其增殖、凋亡和細胞周期的變化以及在信號通路中的作用。初步探討LncRNA_473在ADSCs修復成纖維細胞放射損傷中的作用。方法:細胞因子蛋白芯片篩查共培養(yǎng)上清中的差異表達并進行Elisa驗證。用篩查出的細胞因子刺激放射損傷的成纖維細胞,檢測其增殖、凋亡及周期的變化,Western-blot檢測相關通路的激活情況。成纖維細胞轉染shRNA沉默LncRNA_473,檢測ADSCs共培養(yǎng)干預下成纖維細胞增殖和凋亡情況。結果:細胞因子GM-CSF組和VEGF組較對照組p-Akt和p-Erk表達上調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),這說明GM-CSF組和VEGF可能通過激活P13K-Akt和MAPK通路發(fā)揮放射損傷修復作用。ADSCs共培養(yǎng)同時沉默LncRNA_473,成纖維細胞增殖能力較單純ADSCs共培養(yǎng)組成纖維細胞增殖能力下降、凋亡增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:GM-CSF、VEGF和LncRNA 473可能在ADSCs修復成纖維細胞放射損傷中發(fā)揮重要作用。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R818

【參考文獻】

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2 蘇仲奕;楊在亮;湯永永;扈江偉;盛宏霞;徐曼;張斌;陳虎;;人臍帶間充質干細胞修復大鼠放射復合皮膚損傷及其體外致瘤性[J];中國組織工程研究;2014年37期

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本文編號：2280424