發(fā)布時間：2017-09-02 02:10

  本文關鍵詞：經味覺通路的納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒的中樞神經毒性

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【摘要】：研究背景“納米技術”被認為是21世紀的關鍵技術之一,它在現代社會的發(fā)展中起著革命性的變化�！凹{米材料”被定義為一種存在于非結合狀態(tài),或團聚狀態(tài),或與一個或多個聚結的材料,其外部尺寸范圍在1-100納米。隨著納米技術的快速發(fā)展,納米顆粒(Nanoparticles, NPs)普遍應用于工業(yè),農業(yè),化妝品,醫(yī)療保健和生命科學領域。然而,納米材料的使用也伴隨著一定的安全隱患。由于納米材料的大小近似于DNA、蛋白質、病毒和生物分子,納米顆粒具有獨特的生物學效應,這一機制目前還不為人了解。盡管目前很多研究在探尋納米材料和生物宏觀分子、細胞、器官和組織的相互作用,也僅僅初步闡述了納米材料的生物毒性效應,可能是由氧化應激機制和炎癥機制所引起。同時,納米材料的物理化學特性對其毒性也有著重要的影響,這些特性包括大小、形狀、表面電荷、化學組成、表面修飾、金屬雜質、附聚和分散、降解性能,以及“蛋白冠”的形成。最近的體內體外試驗數據表明,納米顆�？梢酝ㄟ^呼吸道吸入、消化道吸收、皮膚接觸、藥物注射、種植體釋放,或者其他方式進入人體,并且通過淋巴循環(huán)、血液循環(huán)或者神經到達第二靶器官,進而產生生物毒性效應。近年來體內實驗發(fā)現,納米顆粒還可通過神經進入組織,吸入或者鼻內滴入的納米顆粒能夠通過嗅上皮及相關的神經元直接進入大腦的嗅葉,從而進入中樞神經系統(tǒng),誘發(fā)顯著的炎癥相關反應。這條通道包括嗅覺器官或者三叉神經系統(tǒng),通道起始于腦區(qū),繞開血腦屏障,終于鼻腔的嗅上皮或者呼吸上皮。鼻內滴注納米二氧化鈦顆粒,顆�？梢酝ㄟ^嗅神經通路進入大腦皮層和海馬。此外,亞急性和亞慢性吸入納米氧化鋅顆粒,顆粒會高度溶解在肺部組織,并且納米氧化鋅可以通過易位進入血液循環(huán)。神經系統(tǒng)的內臟感覺傳導通路分為一般內臟感覺傳導通路和特殊內臟感覺傳導通路,其中,嗅覺和味覺同屬于特殊內臟感覺傳導通路,二者具有一定的相似性。鑒于納米顆�？梢酝ㄟ^鼻腔滴注進入嗅細胞,從而進入嗅覺神經通路,引起動物體內的神經毒性作用,那么舌體滴注納米顆粒是否也可以通過味蕾進入味覺神經通路,引起動物體內的神經毒性作用呢?因此,本研究擬采用成年雄性Wistar大鼠進行舌體滴注,分別選用納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液,隔天給藥30 d,探索納米顆粒能否通過舌體滴注進入味覺神經通路,繼而進入中樞神經系統(tǒng),并評價其中樞神經毒性的影響。研究目的1. 舌體滴注納米氧化鋅和納米二氧化鈦兩種混懸液,探索納米顆粒能否通過味覺神經通路進入動物體內2. 評估舌體滴注的納米顆粒通過味覺神經通路在動物體內沉積的含量3.檢測氧化應激相關指標,評估納米顆粒的中樞神經毒性作用4.腦組織形態(tài)學觀察和免疫組化分析,探索納米顆粒進入動物體內對中樞神經毒性的影響5.采用水迷宮實驗探索納米顆粒對大鼠空間記憶及學習認知功能的影響本論文主要包括以下兩章內容：第一章納米顆粒通過味覺神經通路進入Wistar大鼠材料與方法1.納米材料的表征1)透射電子顯微鏡(TEM)觀察表面形貌使用TEM觀察納米氧化鋅和納米二氧化鈦的形態(tài)和結構,計算納米氧化鋅和納米二氧化鈦的平均粒徑。2)納米材料化學成分的分析采用X線光譜儀(EDS)對納米氧化鋅和納米二氧化鈦進行化學成分分析。3)X射線衍射物相分析(XRD)采用XRD設備分析納米氧化鋅和納米二氧化鈦的晶相,在室溫下,采用Ni過濾的Cu-Ka射線進行。4)納米材料的Zeta電位和團聚程度分析分別將納米氧化鋅和納米二氧化鈦納米材料分散于無菌水中,漩渦震蕩1mmin,配置成納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液。使用Zeta電位測定儀測量納米顆粒懸液的Zeta電位和水合粒徑。2.動物模型的構建及神經和腦組織元素含量檢測1)配液用天平分別稱量1.5 g的納米氧化鋅和納米二氧化鈦粉末,分別倒入裝有30mL無菌水的100 mL血清瓶中,用標簽紙在瓶蓋上分別標記為“納米氧化鋅”和“納米二氧化鈦”。使用漩渦混勻器大力混勻,溶液濃度為50 mg/mL。將裝有納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液的血清瓶放入水浴鍋進行加熱,當水浴鍋溫度達到85-100℃時,用天平分別稱量0.3 g羥丙基甲基纖維素(HPMC)按照1%的比例,分別加入到納米氧化鋅和納米二氧化鈦血清瓶中。2)超聲混勻將配置好的混懸液放入超聲機中,頻率調至95%,溫度調至40℃,超聲90min,反復多次超聲。每次給藥前將配置好的混懸液再次加熱,用漩渦混勻器大力混勻,瓶底無沉淀后,放入超聲機中超聲約30 min,直至藥物均勻分散,無沉積,無明顯團聚現象即可。3) 動物的選擇從南方醫(yī)科大學動物中心購買體重為120-150 g的成年雄性Wistar大鼠30只,隨機分組,其中納米氧化鋅組、納米二氧化鈦組、對照組各10只,要求大鼠身體健康,活動度正常,毛發(fā)色澤及密度正常。4)麻藥的配制用天平稱量1.0 g的戊巴比妥鈉,放入裝有100 mL生理鹽水的血清瓶中,麻藥濃度為1%,振蕩混勻,直至無肉眼可見的顆粒物。5)給藥腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.48 mL/100 g,麻醉起效時間3-10 min,持續(xù)時間約2-3h。用微型注射器根據動物體重在舌體上逐滴滴加5 mg/100 g納米氧化鋅和納米氧化鈦混懸液,給藥時間為第1、3、5、7……27、29 d,隔天給藥,第30 d麻醉斷頸處死,提取組織檢測。6)神經組織和腦元素含量檢測提取大鼠的鼓索和舌咽神經、小腦、腦干、大腦皮層、海馬,采用ICP-MS檢測納米氧化鋅組Zn元素的含量,納米二氧化鈦組大Ti元素的含量,對照組Zn元素和Ti元素的含量。7)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析,測定結果均以x±s表示,組間采用單因素方差分析(One Way ANOVA),檢驗方差齊性,如果方差齊則對樣本均數進行兩兩比較的LSD檢驗；如果方差不齊則采用Dunnett'sT3檢驗進行兩兩比較,假設檢驗為雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。3.腦組織及神經組織透射電子顯微鏡的檢測分別提取納米氧化鋅組,納米二氧化鈦組和對照組大鼠的海馬,大腦皮層和神經組織(鼓索),放入固定液中固定,然后取出包埋,切片,觀察組織中是否存在納米顆粒,及組織的損傷情況。結果1.表征結果顯示,納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒純度高,無雜質,粒徑為50 nm,制備的納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液分散均勻,無明顯團聚或沉淀。2.采用ICP-MS檢測納米氧化鋅組Zn元素含量,納米二氧化鈦組Ti元素含量,與對照組的Zn元素和Ti元素分別進行比較,發(fā)現實驗組神經組織和腦組織(小腦,腦干,大腦皮層,海馬)的Zn元素和Ti元素明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。3.腦組織和神經組織的TEM結果顯示,納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層均可見組織中有散在的納米顆粒沉積,部分細胞及細胞器形態(tài)改變,如線粒體腫脹、嵴斷裂,內質網腫脹,膠質細胞出現核固縮,核固裂,神經元凹陷,胞質空,板層松解,形成空泡,髓鞘軸漿萎縮,形成空泡,還可見自噬體、溶酶體形成。對照組未見明顯的納米顆粒沉積,細胞及細胞器形態(tài)良好。第二章納米顆粒通過味覺神經通路入腦的中樞神經毒性材料與方法1.納米顆粒對腦組織的氧化應激損傷1)將冰凍的樣本取出,分別提取納米氧化鋅,納米二氧化鈦,對照組的腦組織0.2 g,生理鹽水稀釋,盡可能保證樣品在4℃環(huán)境中,使用組織勻漿機制備組織勻漿(1：9 w/v),約3-5次,每次間隔30-60s,共約10 min,離心,轉速2500 r/min,收集上清液。2)分別檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活性,丙二醛(MDA)的含量,還原型谷胱甘肽(GSH)的含量,谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)的含量,谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。根據說明書添加相應試劑。在96孔板上進行種板,采用熒光酶標儀測量熒光強度,激發(fā)和發(fā)射波長。3)氧化應激相關基因的表達收集不同組大鼠的腦組織,制作組織勻漿后,提取總RNA,即刻逆轉錄成cDNA,采用qRT-PCR法檢測氧化應激相關基因,如Dhcr7、Cyp51、Gsr、 Nox1、Sod2、Nqo1、Fmo2表達水平的改變。選擇大鼠的β-actin基因作為內參。4)統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析,測定結果均以x±s表示,組間采用單因素方差分析,檢驗方差齊性,如果方差齊則對樣本均數進行兩兩比較的LSD檢驗；如果方差不齊則采用Duinnett's T3檢驗進行兩兩比較,假設檢驗為雙側檢驗,檢驗水準a=0.05。2.腦組織形態(tài)學觀察及免疫組化分析1)將取出的腦組織固定,石蠟包埋,用切片機切片,切片厚度約4μm。2)將切片進行蘇木精-伊紅染色(HE),正置光學顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學改變。3)免疫組化分析,采用Ki-67觀察增殖細胞的存在,采用八羥脫氧鳥苷酸(8-OHDG)觀察DNA損傷情況,采用神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)觀察星形膠質細胞的存在,隨機選擇大腦皮層和海馬組織的區(qū)域,進行拍照(棕色)。3.動物行為學分析納米顆粒產生的中樞神經毒性1)水迷宮為一個直徑約2.0 m的圓鋼管混凝土,深度約80 cm,水溫基本恒定在26℃,填滿水后添加不透明的黑色墨水。水池分為四個象限：東北(NE),東南(SE)、西南(SW)和西北(NW)。內置一個圓形平臺(直徑10 cm),置于象限中央,水面高度控制在圓形平臺上方2 cm的位置。2)記錄大鼠1-7 d在水迷宮尋找平臺所用的時間和運動軌跡。3)采用SPSS20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析,測定結果采用重復測量方差分析和多元方差分析,進行不同時間點和不同組間的兩兩比較,檢驗方差齊性,檢驗水準a=0.05。4)學習記憶相關基因的表達收集不同組大鼠的腦組織,制作組織勻漿后,提取總RNA,即刻逆轉錄成cDNA,采用qRT-PCR法檢測學習記憶相關基因,如Sgk1、Drd2、Trappc4、 Gnaq表達水平的改變。選擇大鼠的β-actin基因作為內參。結果1.納米顆粒對腦組織氧化應激損傷的檢測1)納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組SOD的活性均顯著低于對照組,提示組織抗氧化能力下降。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組MDA的含量均顯著高于對照組,提示組織出現了脂質過氧化。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組GSH,GSH-Px,GSH/GSSG的含量均顯著低于對照組,提示組織抗氧化能力下降,出現了氧化應激損傷。2)與對照組比較,兩組實驗組Dhcr7表達顯著下調、Cyp51和Nqo1表達顯著上調、納米氧化鋅組Gsr和Fmo2表達顯著上調、納米二氧化鈦組Sod2表達顯著上調、兩組實驗組Noxl表達水平無顯著性差異,提示組織氧化應激相關基因表達水平改變,可能出現了氧化應激損傷。2.腦組織形態(tài)學觀察及免疫組化分析1)在正置顯微鏡下觀察可見,HE染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中,可見組織松解,出現裂隙,細胞排列松散,對照組組織未見明顯異常,說明實驗組腦組織發(fā)生了一定程度的病理改變。2)在正置顯微鏡下觀察可見,Ki-67染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中,增殖細胞數目較對照組少；8-OHDG染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中,DNA損傷的細胞數目較對照組多；GFAP染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中,星形膠質細胞數目較對照組多；說明實驗組腦組織出現了損傷,細胞增殖能力下降,可能出現神經退化。3.納米顆粒產生的腦毒性對動物行為學分析的影響1)在第1、2、3、5、8 d,納米氧化鋅組大鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組,具有統(tǒng)計學差異。在第6 d,納米氧化鋅組大鼠經過平臺并停留的時間明顯短于對照組,具有統(tǒng)計學差異。2)在第2、3、4、5、8 d,納米二氧化鈦組大鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組,具有統(tǒng)計學差異。在第6 d,納米二氧化鈦組大鼠經過平臺并停留的時間明顯短于對照組,具有統(tǒng)計學差異。3)與對照組比較,兩組實驗組Sgk1、Drd2、Trappc4、Gnaq表達均顯著下調,提示腦組織學習記憶相關基因的表達改變,可能具有中樞神經毒性。結論1.通過對Wistar大鼠舌體滴注納米顆粒的方式給藥30 d,納米顆�？稍谀X組織中沉積。2. 采用氧化應激試劑盒進行檢測,發(fā)現納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組腦組織清除超氧陰離子自由基的SOD活性降低,脂質過氧化產物MDA含量升高,GSH,GSH-Px,GSH/GSSG下降,提示腦組織抗氧化能力下降,發(fā)生了氧化應激的損傷。3.組織形態(tài)學觀察發(fā)現,納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬組織松解,細胞排列松散,提示腦組織發(fā)生了病理改變。4. 免疫組化分析,納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬組織細胞增殖能力下降,出現了DNA損傷,可能伴有神經退化。5.氧化應激相關基因表達水平部分出現了上調或下調,說明腦組織氧化應激相關基因表達水平改變,進一步提示腦組織發(fā)生了氧化應激損傷。6.行為學分析發(fā)現,納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大鼠的認知和學習記憶能力較對照組下降,說明納米顆粒引起了腦組織的學習記憶和認知功能的障礙。7.學習記憶相關基因表達水平均出現了下調,說明腦組織學習記憶相關基因表達水平改變,提示腦組織在學習記憶和認知功能方面出現了損害。
【關鍵詞】：納米顆粒 氧化鋅 二氧化鈦 組織分布 神經毒性 氧化應激
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-25
• 第一章 納米顆粒通過味覺神經通路進入Wistar大鼠25-42
• 實驗一 納米材料的表征26-33
• 實驗二 動物模型的構建及神經和腦組織元素含量檢測33-38
• 實驗三 腦組織和神經組織透射電子顯微鏡檢測38-42
• 第二章 納米顆粒通過味覺神經通路入腦的中樞神經毒性42-64
• 實驗一 納米顆粒對腦組織的氧化應激損傷42-51
• 實驗二 腦組織形態(tài)學觀察及免疫組化分析51-59
• 實驗三 動物行為學分析納米顆粒產生的中樞神經毒性59-64
• 參考文獻64-72
• 全文總結72-74
• 附錄74-75
• 攻讀碩士學位期間成果75-77
• 致謝77-78

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