發(fā)布時間：2017-06-25 15:03

  本文關鍵詞：金屬硫蛋白對氧糖剝奪再灌注誘導星形膠質細胞損傷的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金屬硫蛋白（Metallothionein, MT）是一類富含半胱氨酸，，分子量較低的金屬結合蛋白，具有解毒重金屬、調節(jié)必需金屬自穩(wěn)和抗氧化應激的功能。目前研究發(fā)現哺乳動物體內MT共有四種亞型，其中MT-1、 MT-II（MT-I/II）和MT-III是中樞神經系統中的主要異構形式。MT-I/II主要表達于星形膠質細胞，MT-III主要表達于神經元。近年來越來越多的研究表明MT-I/II在腦缺血等疾病中有重要的神經保護功能，但其具體作用靶位和機制均還不清楚。 目的：本課題應用MT-I/II基因敲除（MT-/-）小鼠和野生型（MT+/+）小鼠，分別建立原代培養(yǎng)的新生小鼠腦皮層星形膠質細胞模型，并通過細胞胞氧糖剝奪培養(yǎng)（Oxygen glucose deprivation, OGD）和再復糖復氧，即再灌注（Reperfusion,Rep）建立體外模擬缺血再灌注模型，旨在闡明MT-I/II對OGD/Rep誘導的星形膠質細胞損傷的作用并探討其可能的作用機制；同時觀察了MT-I/II在外源性化合物（白藜蘆醇）介導的星形膠質細胞保護效應中的作用。 方法與結果：分別應用C57BL/OLA129MT+/+和MT-/-新生小鼠，建立腦皮層星形膠質細胞體外原代培養(yǎng)模型，并針對星形膠質細胞特異性蛋白（GFAP）應用免疫細胞化學法進行細胞純度鑒定。結果表明，培養(yǎng)細胞純度可達到90%以上，通過細胞形態(tài)學觀察、細胞計數表明，MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質細胞的生長、形態(tài)學等特征均基本相似，提示生理條件下MT-I/II基因敲除對星形膠質細胞結構和功能沒有顯著影響。對MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質細胞分別進行氧糖剝奪再灌注實驗，通過觀察細胞形態(tài)變化，檢測細胞存活率、細胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率及細胞凋亡率來評價MT對OGD/Rep所致星形膠質細胞毒性的影響。結果顯示，OGD對星形膠質細胞有明顯的細胞毒性，且Rep過程會加劇細胞損傷。形態(tài)學觀察發(fā)現細胞發(fā)生皺縮、體積變小、核周空泡化及細胞死亡，細胞存活率下降，LDH漏出率和細胞凋亡率明顯增加。且MT-/-小鼠星形膠質細胞的損傷程度明顯高于MT+/+型細胞，該結果表明MT的缺失使星形膠質細胞對OGD/Rep引起的細胞損傷更為敏感，可見MT-I/II對OGD/Rep引起的星形膠質細胞損傷有一定的保護作用。 白藜蘆醇是一種多酚類化合物，近年來研究表明白藜蘆醇對腦缺血損傷具有明顯的保護作用，并提示其作用機制與MT-I/II密切相關，但具體作用機制尚不清楚。為了進一步證實MT在白藜蘆醇介導的抗腦缺血損傷中的作用，我們分別將白藜蘆醇加入MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質細胞模型，旨在闡明白藜蘆醇是否通過調節(jié)MT來發(fā)揮其神經保護作用。MT+/+星形膠質細胞給予不同濃度的白藜蘆醇（10nM、100nM、1μM、10μM）處理，經過OGD/Rep后觀察其形態(tài)學改變，選取合適濃度（10μM）進行下一步研究。對MT+/+和MT-/-星形膠質細胞給予10μM白藜蘆醇處理并進行OGD/Rep，在形態(tài)學觀察上得出白藜蘆醇有效改善了MT+/+細胞空泡化和死亡的發(fā)生。通過對LDH漏出率的測定及與未加入白藜蘆醇組進行比較，在加入了保護性藥物Res后，LDH漏出有一定的降低，且對MT+/+的作用更明顯，尤其在Rep階段（P0.05），明顯降低了LDH漏出率，體現了Res的保護作用。 為檢測細胞的氧化損傷程度，通過熒光探針標記法檢測細胞OGD/Rep及給藥處理后線粒體膜電位和細胞內ROS水平，結果顯示，細胞在給予OGD/Rep處理后線粒體膜電位降低，ROS水平升高，即發(fā)生氧化損傷，且MT-/-細胞損傷程度較MT+/+細胞更嚴重；加入保護性藥物白藜蘆醇后，細胞的損傷有所改善，且對MT+/+細胞保護更明顯。 氧化損傷產生的ROS最先由SOD轉化清除，兩種細胞再灌注不同時間（2h,6h,12h,24h）后，測定MT-I/II和重要抗氧化物Mn-SOD的mRNA表達水平。結果顯示，對MT+/+細胞給予OGD/Rep處理后MT-I/II在Rep24h時MT-I/II表達都顯著上升，表明星形膠質細胞中MT-I/II在Rep12-24h間表達上調并發(fā)揮作用。將MT+/+與MT-/-兩種細胞再灌注過程SOD表達進行比較可得出，MT+/+細胞OGD/Rep處理后Mn-SOD mRNA也在Rep24h時表達突然上升，這與MT-I/II的表達變化時間一致。MT-/-細胞在發(fā)生OGD后SOD表達減少，在Rep6h時表達上調并隨著Rep時間加長表達逐漸下降，這兩種細胞SOD的表達有明顯的差異性，MT-/-細胞可能由于缺失了MT這一重要抗氧化蛋白，在受到氧化應激時細胞通過調節(jié)SOD等抗氧化物表達來達到自身保護作用。加入保護性藥物白藜蘆醇，MT-I/II mRNA在Rep6h時兩者都表達上調，跟未加白藜蘆醇組相比（在Rep24h顯著上升），MT上調的時間提前了18h。MT+/+星形膠質細胞在Rep6h時表達上升，與未加藥組相比（上升時間點為Rep24h），SOD上調的時間提前了18h，且其趨勢與MT表達變化相似； MT-/-細胞在OGD后SOD水平立即下降至極低，在Rep2h時恢復至正常水平，與未加藥組相比（Rep6h表達升高），SOD上調的時間提前了4h。從這些結果可得出白藜蘆醇能調節(jié)MT-I/II和SOD的表達來發(fā)揮保護作用，白藜蘆醇對MT+/+細胞SOD的調節(jié)水平較MT-/-更明顯，也提示了白藜蘆醇調節(jié)MT-I/II可能是抗氧化應激作用的作用機制。 結論：綜上所述，本課題應用MT-I/II基因敲除小鼠和野生型小鼠分別建立原代培養(yǎng)的新生小鼠腦皮層星形膠質細胞模型，并通過細胞胞氧糖剝奪培養(yǎng)和再復糖復氧建立了體外模擬缺血再灌注模型。應用這些模型證實了MT-I/II對OGD/Rep誘導的星形膠質細胞損傷具有明顯的保護作用，提示其作用機制與保護細胞抗氧化酶MnSOD密切相關；同時證實白藜蘆醇有可能通過調節(jié)MT-I/II的表達以發(fā)揮其抗腦缺血損傷作用。
【關鍵詞】：金屬硫蛋白 氧糖剝奪再灌注 星形膠質細胞 損傷 白藜蘆醇
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-24
• 實驗結果24-40
• 討論40-43
• 結論43-44
• 參考文獻44-47
• 文獻綜述47-56
• 參考文獻53-56
• 個人簡歷56-57
• 致謝57

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