本文關(guān)鍵詞：沉默Keap1基因?qū)腔嚓P(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標(biāo)的影響及在砷皮膚角化異常中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:以慢病毒介導(dǎo)的Keap1基因沉默的人角質(zhì)形成細(xì)胞株Ha Ca T細(xì)胞為模型細(xì)胞,研究Nrf2對(duì)角化相關(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標(biāo)的影響及在砷致皮膚毒性中作用,為砷致皮膚毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:1.Keap1 shRNA的構(gòu)建:利用RNAi技術(shù),以人Keap1基因?yàn)榘谢?設(shè)計(jì)Keap1基因特異性的小干擾RNA,構(gòu)建其shRNA,重組慢病毒表達(dá)載體,并進(jìn)行測(cè)序鑒定。2.慢病毒包裝:用重組成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T,收集、濃縮病毒上清液、測(cè)定其滴度;3.Keap1沉默Hacat細(xì)胞模型的構(gòu)建,構(gòu)建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細(xì)胞(MOI=5),感染48小時(shí)后,用1ug/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。4.穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定:篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞株,用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測(cè)干擾效率。5.細(xì)胞培養(yǎng)與染毒:模型細(xì)胞與正常細(xì)胞按細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。6.MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,確定染毒濃度,染毒濃度別為L(zhǎng)C50的1/100、1/50、1/10。7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況:參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表達(dá)水平。9.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。2.慢病毒滴度測(cè)試結(jié)果:依據(jù)滴度(TU/ml)=細(xì)胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×10^3選取最佳滴度的病毒。3.選取Keap1 shRNA1 Hacat細(xì)胞,其基因的沉默效率為71%。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L,分別為低、中、高劑量組,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染毒濃度為0μmol/L。5.細(xì)胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞,細(xì)胞明顯增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞48h開始明顯抑制細(xì)胞增殖�？瞻讓�(duì)照細(xì)胞增值率略低于0μmol/L染毒組。6.細(xì)胞凋亡:2.90μmol/L染毒時(shí),各時(shí)間段細(xì)胞凋亡率均低于正常對(duì)照組,提示2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞,在促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞凋亡率也逐漸增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞8h、24h后能促進(jìn)Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表達(dá)上調(diào);29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默細(xì)胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞能促進(jìn)N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表達(dá);29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞N6AMT1、SAM、HCY蛋白的表達(dá)量下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);29.00μmol/L COX-2蛋白的表達(dá)量仍遠(yuǎn)于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.細(xì)胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞,細(xì)胞明顯增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞48h開始明顯抑制細(xì)胞增殖�？瞻讓�(duì)照細(xì)胞增值率略低于0μmol/L染毒組,提示沉默Keap1基因后Nrf2高表達(dá)有利于細(xì)胞的增殖,混合砷液對(duì)細(xì)胞的增殖影響具有時(shí)間-劑量依賴性。細(xì)胞凋亡:2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞,在促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞凋亡率也逐漸增加;隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞的凋亡率也上升,提示混合砷液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有一定的時(shí)間-劑量依賴性。2.混合砷染毒Keap1沉默Ha Ca T細(xì)胞,Nrf2處于高表達(dá)狀態(tài),隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢(shì),但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T細(xì)胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達(dá)發(fā)生改變,隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)、染毒濃度增加能使基因表達(dá)逐漸下調(diào)。4.Keap1沉默Ha Ca T細(xì)胞染毒后在8h、24h檢測(cè)到LORmRNA表達(dá)為陰性,2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒組在72h檢測(cè)到LOR mRNA上調(diào),29.00μmol/L組在48h、72h檢測(cè)到LOR mRNA上調(diào)。5.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T細(xì)胞中N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白表達(dá)發(fā)生改變:隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)、染毒濃度增加表達(dá)量逐漸下降。6.混合砷液對(duì)Keap1沉默HaCa T細(xì)胞的毒性作用受時(shí)間和濃度交互作用的影響,可推測(cè)砷暴露隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),染毒濃度的加大對(duì)皮膚細(xì)胞的損害越嚴(yán)重。
【關(guān)鍵詞】：Ha Ca T細(xì)胞 細(xì)胞活性 基因表達(dá) 慢病毒 Real-time PCR ELISA
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-31
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-30
• 3. 統(tǒng)計(jì)分析30
• 4. 質(zhì)量控制30-31
• 結(jié)果31-58
• 討論58-64
• 小結(jié)64-65
• 致謝65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 綜述72-82
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文82-83
• 導(dǎo)師評(píng)閱表83

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：392108