發(fā)布時間：2019-04-03 20:28

【摘要】：研究背景： 食品化學污染物是食源性疾病的重要病因之一,食品化學污染物包括重金屬、農(nóng)藥、毒素以及食品加工過程中形成的有毒有害物質等,然而,人們以往對這些物質對機體健康影響的研究往往過多關注其對健康影響的傳統(tǒng)毒性,對其潛在危害如：免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)等特殊毒性影響卻研究不多。丙烯酰胺是高溫烹飪的淀粉類食品中常見的食品內(nèi)源性污染物之一,已有大量研究數(shù)據(jù)顯示,丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性和生殖毒性,而有關免疫毒性缺乏系統(tǒng)性研究；因此本研究對丙烯酰胺的免疫毒性從體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫等幾方面進行了系統(tǒng)研究。2014年國家食品安全風險評估專家委員會也將丙烯酰胺列為優(yōu)先評估項目,將對丙烯酰胺進行重新評估,目前正廣泛收集丙烯酰胺的相關毒性資料,本研究結果也將為丙烯酰胺對健康影響的風險評估提供毒理學的科學數(shù)據(jù)。 隨著科學技術的快速發(fā)展和生活水平的提高,消費者對食品的要求也逐步提高,藥食兩用物質由于其具有提高機體免疫力和特殊的營養(yǎng)功效,受到各國食品行業(yè)的青睞。然而藥食兩用物質雖然具有較高的開發(fā)和利用價值,但是由于其成分的復雜性,如果大量服用,均可引發(fā)潛在危害甚至死亡,因此藥食兩用物質進行安全性評價的同時,也需要關注其神經(jīng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾作用等特殊毒性,從而為該類物質作為新藥開發(fā)或者保健型食品的開發(fā)提供科學依據(jù)�？喙鲜墙陙韨涫荜P注的藥食兩用物質之一,然而大部分研究多集中于對苦瓜及其提取物的功效研究方面,對于苦瓜及其提取物對免疫毒性的研究報道還很少,因此本研究選擇苦瓜提取物作為受試物,全面評價苦瓜提取物對BALB/c小鼠免疫功能的影響。 機體的免疫系統(tǒng)是毒性物質最直接的攻擊目標,繼而引發(fā)機體出現(xiàn)不良反應,包括健康并發(fā)癥如：易感性增加、癌癥、過敏性反應和自身免疫性疾病的產(chǎn)生等等,因此在外源性化學物誘發(fā)機體出現(xiàn)一些不良反應之前,免疫系統(tǒng)已經(jīng)表現(xiàn)為受到損害(淋巴結細胞構成改變、淋巴細胞亞群改變、宿主抵抗力下降、特異性免疫功能應答改變等),因此免疫系統(tǒng)的毒性改變是某些外源性化學物安全性評價中較為敏感的指標,對物質進行免疫毒理學評價是十分必要的。 研究目的： (1)參照ICH提出的免疫毒性評價指導原則,通過體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫及附加免疫學實驗的檢測指標,對丙烯酰胺的免疫毒性進行評價,并且初步探究了丙烯酰胺的免疫毒性靶點及其可能的毒性機制,完善其免疫毒理學資料,并為今后對丙烯酰胺對健康的風險評估提供科學數(shù)據(jù)。 (2)參照ICH提出的免疫毒性評價指導原則,通過體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫及附加免疫學實驗的檢測指標,對苦瓜提取物進行免疫毒性評價,為進一步評價苦瓜提取物的食用安全性評價提供免疫毒理學資料。 研究方法： (1)丙烯酰胺對BALB/c小鼠免疫毒性的研究選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗周期為30天。共5個免疫組,分別用于一般毒性和免疫病理學檢測、體液免疫實驗、細胞免疫實驗及附加免疫實驗；每個免疫組設5個試驗組,即陰性對照組(蒸餾水)、丙烯酰胺低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性對照組(環(huán)磷酰胺)。 一般毒性和免疫病理學指標：小鼠體重、免疫器官及其它臟器的重量及臟器系數(shù)；血液學指標；血生化指標；肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結(頸部淋巴結、腋下淋巴結、耳部淋巴結、腸系膜淋巴結、Peyer氏淋巴結)、骨髓的組織病理學觀察。體液免疫包括：T細胞依賴性抗體反應(測定脾空斑形成細胞數(shù),PFC)、血清溶血素的測定和血漿免疫球蛋白水平(酶聯(lián)免疫吸附法法測定血漿IgA、IgM口IgG水平)。細胞免疫包括：ConA誘導的脾T淋巴細胞增殖試驗和LPS誘導的脾B淋巴細胞增殖試驗。非特異性免疫包括：NK細胞活性的測定和巨噬細胞功能的測定(小鼠碳廓清試驗)。附加免疫實驗指標：血清細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的測定,外周血淋巴細胞表型分析包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、Th細胞、Ts細胞比例,這兩種檢測均采用流式細胞技術。 (2)丙烯酰胺免疫毒性機制的初步探討選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗周期為30天。設5個試驗組,即陰性對照組(蒸餾水)、丙烯酰胺低劑量組、中劑量組和高劑量組,以及陽性對照組。 試驗結束后,取各組脾臟和胸腺組織,并將脾臟和胸腺切分為兩部分,一部分使用液氮凍存?zhèn)溆茫涣硪徊糠忠?%甲醛固定作病理分析。通過TUNEL法檢測脾臟和胸腺中的細胞凋亡水平；RT-PCR方法檢測脾臟、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的mRNA水平,通過Western blotting方法檢測脾臟、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的蛋白表達水平。 (3)苦瓜提取物對的BALB/c小鼠免疫毒性的研究選用雌性BALB/c小鼠,動物經(jīng)適應性飼養(yǎng)3天后按體重將動物隨機分組,每組動物10只,按組分籠飼養(yǎng),每籠5只動物。試驗周期為30天。共5個免疫組,分別用于一般毒性和免疫病理學檢測、體液免疫試驗、細胞免疫實驗及附加免疫實驗；每個免疫組設5個試驗組,即陰性對照組(蒸餾水)、苦瓜提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性對照組(環(huán)磷酰胺)。 一般毒性和免疫病理學指標：小鼠體重、免疫器官及其它臟器的重量及臟器系數(shù)；血液學指標；血生化指標；肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結(頸部淋巴結、腋下淋巴結、耳部淋巴結、腸系膜淋巴結、Peyer氏淋巴結)、骨髓的組織病理學觀察。體液免疫包括：T細胞依賴性抗體反應(測定脾空斑形成細胞數(shù),PFC)、血清溶血素的測定和血漿免疫球蛋白水平(酶聯(lián)免疫吸附法法測定血漿IgA、IgM和IgG水平)。細胞免疫包括：ConA誘導的脾T淋巴細胞增殖試驗和LPS誘導的脾B淋巴細胞增殖試驗。非特異性免疫包括：NK細胞活性的測定和巨噬細胞功能的測定(小鼠碳廓清試驗)。附加免疫實驗指標：血清細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的測定,外周血淋巴細胞表型分析包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、Th細胞、Ts細胞比例,這兩種檢測均采用流式細胞技術。 研究結果： (1)環(huán)磷酰胺作為陽性對照物的研究結果：本研究中采用環(huán)磷酰胺作為陽性對照物,其一般毒性指標和免疫病理學指標的結果顯示環(huán)磷酰胺陽性對照組peyers結個數(shù)減少,脾臟絕對重量和相對重量、胸腺絕對重量較陰性對照組顯著性降低。組織病理學檢測顯示陽性對照組；動物脾臟出現(xiàn)中度萎縮,髓外造血減少,淋巴小結內(nèi)生發(fā)中心縮小或消失；胸腺出現(xiàn)中或輕度萎縮；Peyer氏淋巴結萎縮,濾泡結構不清,生發(fā)中心縮小或消失；骨髓造血細胞減少,且骨髓組織中分葉核細胞比例增加,其余各系細胞減少。血液學結果顯示,陽性對照組白細胞數(shù)、平均紅細胞體積、淋巴細胞、淋巴細胞百分比較陰性對照組顯著降低,平均血紅蛋白濃度、血小板平均體積、血小板分布寬度、單核細胞百分比、中性粒細胞百分比較陰性對照組顯著增高；血生化結果顯示陽性對照組血清血清白蛋白、血清白球比較陰性對照組顯著降低,血清總膽固醇較陰性對照組顯著升高。細胞免疫檢測結果顯示：陽性對照組ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖能力與陰性對照組比較顯著降低,體液免疫檢測顯示,溶血空斑數(shù)、血清HC50值、血漿IgG和IgM水平較陰性對照組顯著降低。外周血淋巴細胞分型結果顯示,陽性對照組小鼠全血總T淋巴細胞(CD3+CD19-)百分比、CD4+T淋巴細胞百分比以及Th/Ts比例均顯著高于陰性對照組；B淋巴細胞(CD3-CD19+)百分比顯著低于陰性對照組。血清細胞因子檢測結果顯示,陽性對照組小鼠血清IL-6水平顯著低于陰性對照組。 (2)丙烯酰胺對BALB/c小鼠的免疫毒性研究結果：丙烯酰胺的試驗結果如下,丙烯酰胺高劑量組第1周、第2周、第3周、第4周體重均顯著低于陰性對照組,終體重、peyers結個數(shù)、腎臟絕對重量、脾臟絕對重量和相對重量、胸腺絕對重量和相對重量與陰性對照組相比顯著降低,組織病理學檢測顯示丙烯酰胺高劑量組：動物脾臟白髓萎縮,其余動物脾臟組織結構清晰,紅髓、白髓及邊緣區(qū)清晰,未見明顯異常。胸腺出現(xiàn)輕度萎縮,淋巴結(頸部、腋下、耳部、腸系膜淋巴結),淋巴濾泡萎縮；peyers結及骨髓組織未見異常；丙烯酰胺低劑量組與中劑量組各組織均未見異常。血液學結果顯示,丙烯酰胺中劑量組紅細胞數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞分布寬度較陰性對照組顯著降低；丙烯酰胺高劑量組紅細胞數(shù)(血紅細胞寬度、平均血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度、淋巴細胞數(shù)、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺高劑量組平均紅細胞體積較陰性對照組顯著升高；其余指標各劑量組與對照組比較無統(tǒng)計學意義。血生化結果顯示,丙烯酰胺高劑量組血清總蛋白、血清白蛋白、總膽固醇較陰性對照組顯著增高,血清甘油三酯較陰性對照組降低。細胞免疫檢測結果顯示：丙烯酰胺高劑量組小鼠脾T細胞增殖能力較陰性對照組顯著降低。體液免疫檢測顯示,丙烯酰胺高劑量組血清HCso值較陰性對照組顯著降低。丙烯酰胺不同劑量組對NK細胞活性無明顯影響。丙烯酰胺三個不同劑量組小鼠全血T淋巴細胞(CD3+CD19-)百分比均顯著高于陰性對照組。外周血淋巴細胞分型結果顯示,丙烯酰胺高劑量組CD4+T淋巴細胞(CD3+CD4-)百分比明顯高于陰性對照組；丙烯酰胺三個劑量組小鼠全血NK細胞百分比均顯著低于陰性對照組。血清細胞因子檢測結果顯示,丙烯酰胺高劑量組小鼠血清IL-6水平顯著低于陰性對照組；丙烯酰胺高劑量組小鼠血清IL-17水平顯著高于陰性對照組；丙烯酰胺低劑量和中劑量組血清IFN-y水平顯著高于陰性對照組和高劑量組。 (3)丙烯酰胺對BALB/c小鼠免疫毒性的機制研究：Tunel法檢測結果顯示,丙烯酰胺中、高劑量組動物脾臟、胸腺的細胞凋亡率顯著高于陰性對照組；陽性對照組動物脾臟細胞凋亡率顯著高于陰性對照組；RT-PCR檢測結果顯示脾臟組織中丙烯酰胺低劑量組及高劑量組Caspase-3的mRNA水平顯著低于陰性對照組,陽性對照組Caspase-3的mRNA水平顯著高于陰性對照組；而胸腺組織中丙烯酰胺低劑量組和陽性對照組PARP的nRNA水平顯著高于陰性對照組。其它各組中Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP基因表達水平與陰性對照組均未見顯著差異。Western blotting檢測結果顯示脾臟組織中丙烯酰胺中劑量組Bcl-2蛋白表達水平較陰性對照組顯著升高、陽性對照組Bax、PARP蛋白表達水平較陰性對照組顯著下降,丙烯酰胺各劑量組及陽性對照組Caspase-3蛋白表達水平較陰性對照組顯著降低；胸腺組織中丙烯酰胺各劑量組和陽性對照組Bcl-2蛋白表達水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺中、高劑量組及陽性對照組PARP蛋白表達水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺各劑量組和陽性對照組Caspse-3蛋白表達水平較陰性對照組顯著降低,丙烯酰胺中劑量組及陽性對照組Bax蛋白表達水平較陰性對照組顯著降低。 (4)苦瓜提取物對BALB/c小鼠的免疫毒性研究結果：一般毒性指標和組織病理學檢測,苦瓜提取物各劑量組動物終體重、Peyer氏淋巴結數(shù)、臟器重量、肝體比、腎體比、脾體比及腺體比與陰性對照組比較均無顯著性差異；苦瓜提取物各劑量組對BALB/c小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、淋巴結及骨髓無影響,血常規(guī)和血生化指標未見影響。體液免疫檢測顯示,苦瓜提取物中劑量組小鼠血清IgG水平高于陰性對照組,苦瓜提取物高劑量組小鼠血清IgA水平高于陰性對照組。細胞免疫檢測顯示,苦瓜提取物低劑量組ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力較陰性對照組顯著升高。外周血淋巴細胞分型結果顯示,苦瓜提取物受試物中劑量組NK細胞(CD3-CD49+)百分比顯著低于陰性對照組。血清細胞因子檢測結果顯示,苦瓜提取物低劑量組IL-6、IL-4、TNF水平顯著高于陰性對照組。 研究結論： (1)本研究為國內(nèi)外首次對丙烯酰胺的免疫毒性進行系統(tǒng)評價,研究發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺對免疫器官脾臟、胸腺、淋巴結均有明顯的毒性作用,對一些免疫病理學、細胞免疫、體液免疫指標有明顯抑制作用,但未見其對非特異性免疫功能有明顯毒性作用。在本研究試驗條件下,丙稀酰胺在低劑量時即可觀察到小鼠的全血T細胞和NK細胞比例顯著降低以及血清細胞因子IFN-y顯著升高,可以初步得出丙烯酰胺的LOAEL為4mg/kgBW。 (2)凋亡通路可能是丙烯酰胺導致小鼠免疫器官出現(xiàn)損傷的重要作用途徑,是其產(chǎn)生免疫毒性作用的機制之一。丙烯酰胺對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒作用的機制可能是通過其誘導脾臟和胸腺組織中Caspase-3蛋白的過度活化,并且抑制了胸腺組織Bcl-2的正常表達,使Bcl-2和Bax的相互協(xié)調(diào)作用失衡,導致脾臟和胸腺細胞過度凋亡,使脾臟和胸腺出現(xiàn)萎縮,最終引發(fā)免疫功能出現(xiàn)障礙；然而該過程中還有許多分子機制的參與,因此今后還需進一步對丙烯酰胺長期暴露對機體的影響以及全面的分子機制進行探討。 (3)本研究為國內(nèi)外首次對苦瓜提取物的免疫毒性進行系統(tǒng)評價,在本研究劑量范圍內(nèi),苦瓜提取物對正常BALB/c小鼠的免疫功能無明顯毒副作用,苦瓜提取物對小鼠血清免疫球蛋白IgA、IgM的產(chǎn)生,以及細胞因子IL-6、IL-4的分泌有明顯的促進作用,苦瓜提取物低劑量組ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力較陰性對照組顯著升高,說明苦瓜提取物對小鼠的細胞免疫、體液免疫有一定的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2453549