【摘要】：本論文對(duì)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中四環(huán)素殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。采用甲醛法將四環(huán)素與鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)制備人工免疫原。通過(guò)免疫新西蘭大白兔得到抗血清,使用Protein A Sepharose-4B親和層析法純化血清得到高效價(jià)和高特異性的抗四環(huán)素多克隆抗體。采用甲醛法將四環(huán)素與卵血清白蛋白連接制備包被原,建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,對(duì)影響實(shí)驗(yàn)的各因素(包被量,抗體稀釋度,抗體稀釋液等)進(jìn)行了優(yōu)化與研究,最終確定包被量為0.05¨μgg/孔,抗體稀釋度為1：10000,抗體稀釋液為0.1%BSA/PBS,封閉液為0.5%乳粉/PBS溶液時(shí)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度最高,穩(wěn)定性最好。本實(shí)驗(yàn)所建立方法的靈敏度(IC50)為0.33±0.09μg/L,最低檢出限(IC15)為0.01±0.0041μg/L。本實(shí)驗(yàn)所制備的抗體具有良好的特異性,與兩種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物土霉素、金霉素交叉反應(yīng)率分別為0.39%和4.42%,與其他常用獸藥青霉素、鏈霉素、氯霉素均無(wú)交叉反應(yīng)。選擇牛奶、蜂蜜、豬肉、牛肉、雞肉、魷魚(yú)、大眼鯛魚(yú)、比目魚(yú)、蝦作為樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),牛奶添加回收率為85.88%-109.17%,蜂蜜添加回收率為94.52%-107.59%,豬肉添加回收率為84.19%-98.96%,牛肉添加回收率為75.91%-105.58%,雞肉添加回收率為84.40%-109.64%,魷魚(yú)添加回收率為73.08%-115.44%,大眼鯛魚(yú)添加回收率為67.45%-104.76%,比目魚(yú)添加回收率為74.55%-112.46%,蝦添加回收率為82.84%-111.85%。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法在牛奶、魷魚(yú)中檢出限為5μg/kg,蜂蜜、豬肉、牛肉、雞肉、大眼鯛魚(yú)、比目魚(yú)、蝦檢出限為10μg/kg,板內(nèi)變異和板間變異均小于20%。使用國(guó)外試劑盒驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的四環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性很高,其線性回歸方程為：y=0.8542x+2.2848,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9954。說(shuō)明本研究建立的方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密度。本研究所建立的四環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確性高、樣品前處理簡(jiǎn)單,適合于動(dòng)物源性食品中四環(huán)素殘留的快速檢測(cè)。
[Abstract]:In this paper, indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) for the detection of tetracycline residues in animal-derived foods was systematically studied. Artificial immunogen was prepared by coupling tetracycline with keyhole hemocyanin by formaldehyde method. Anti-tetracycline polyclonal antibodies were obtained by immunizing New Zealand white rabbits and purified by Protein-A-Sepharose-4B affinity chromatography. An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) was established by linking tetracycline with ovalbumin by formaldehyde method. The factors influencing the experiment, such as coating quantity, antibody dilution, antibody diluent, etc., were optimized and studied. The best stability and sensitivity of the standard curve were obtained when the coating volume was 0.05 渭 gg/, the dilution of antibody was 1 脳 10 000, the diluent of antibody was 0.1% BSA / PBS, and the blocking solution was 0.5% milk powder / PBS. the results showed that the best stability and sensitivity of the standard curve were obtained when the coating volume was 0.05 渭 mol / min, the dilution of antibody was 1? The sensitivity (IC50) and the minimum detection limit (IC15) of the method were 0.33 鹵0.09 渭 g / L and 0.01 鹵0.0041 渭 g / L, respectively. The cross-reaction rates with oxytetracycline and chloramphenicol were 0.39% and 4.42%, respectively. There was no cross-reaction with other commonly used veterinary drugs such as penicillin, streptomycin and chloramphenicol. Choose milk, honey, pork, beef, chicken, squid, big-eyed snapper, halibut, shrimp as samples to add and recycle experiment, milk added recovery rate is 85.88% and 109.17%. The recoveries of honey, pork, beef and chicken were 94.52% and 107.59%, 84.19%, 98.96%, 75.91% and 105.58%, 84.40% and 109.64%, respectively. The recovery of squid and bream was 73.08% / 115.44%, 67.45% / 104.76%, 74.55% / 112.46% and 82.84% / 111.85%, respectively. The detection limit of this method in milk and squid was 5 渭 g / kg, honey, pork, beef, chicken, snapper, halibut and shrimp. The detection limit was 10 渭 g / kg, intraplate variation and interplate variation less than 20%. The test results of tetracycline indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) were verified with foreign kits. The results of the two methods were consistent with each other. The linear regression equation was y = 0.8542 x 2.2848, and the linear correlation coefficient (R _ (2) was R _ (2) = 0.9954. It shows that the method established in this study has good accuracy and precision. The indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for tetracycline detection developed in this study has high sensitivity, specificity, high accuracy and simple pretreatment. It is suitable for the rapid detection of tetracycline residues in animal-derived foods.
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R155.5

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本文編號(hào)：2452277