【摘要】：砷化物是人類確定致癌物,亞砷酸鈉(NaAsO2)是砷元素在環(huán)境中存在的主要形式。由于砷化物致癌實驗動物模型一直未能成功建立,導致其致癌機制研究長期滯后。近年來砷化物所致細胞惡性轉化和DNA損傷及細胞凋亡的體外模型已被應用于其致癌機制研究。目前發(fā)現不同水平砷化物致癌的分子機制可能不同,即低水平砷化物主要引起細胞過度增殖,從而引起細胞發(fā)生惡性轉化而誘發(fā)癌癥；而高水平砷化物可通過產生大量活性氧(ROS)引起DNA損傷和細胞凋亡,從而引起細胞突變和基因組不穩(wěn)定性而誘發(fā)癌癥,但其具體的分子機制目前尚不清楚。 上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤干細胞(Tumor stem cells, TSCs)樣特性獲得參與了多種疾病,特別與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關。近年,雖然EMT和TSCs特性獲得與腫瘤細胞惡性程度和轉移關系及其分子機制的研究已成為熱點,但對于EMT和TSCs特性獲得在環(huán)境致癌物所致細胞惡性轉化及致癌過程中的作用和分子機制的研究報道甚少。因此深入研究不同水平砷化物所致細胞惡性轉化和DNA損傷及細胞凋亡的具體信號通路,特別是研究調控砷化物誘導EMT過程中TSCs特性獲得在惡性轉化過程中的作用及其分子機制對于尋找砷化物致癌的早期生物學標志及發(fā)現新的防治措施具有重要理論意義和實用價值。 方法 一、建立亞砷酸鈉所致人皮膚角質(HaCaT)細胞增殖和惡性轉化及DNA損傷和細胞凋亡模型 常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細胞24h后,再分別用含0.0和1.0μM NaAsO2的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HaCaT細胞48～72h,如此重復培養(yǎng)30代(約15周)后,觀察細胞增殖情況和惡性程度；用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24或48h,觀察細胞增殖、DNA損傷和細胞凋亡情況。 二、軟瓊脂集落形成實驗 將惡性轉化和相關對照的HaCaT細胞與含0.7%低熔點瓊脂糖的RPMI1640培養(yǎng)液等體積混合后,鋪于含0.7%低熔點瓊脂糖的底層培養(yǎng)基上,待其凝固后,表面覆以適量培養(yǎng)液,37;C5%CO2培養(yǎng),每3-4天換液一次,4周后終止培養(yǎng)并計數細胞集落數。 三、裸鼠皮下致瘤實驗 將惡性轉化和相關對照的HaCaT細胞按1×107/0.2mL密度注射于Balb/c裸鼠右側腋窩皮下,飼養(yǎng)4周后將腫瘤組織取出,測量腫瘤體積、固定,并作組織切片、HE染色后進行組織病理學鑒定。 四、逆轉錄PCR (RT-PCR) 提取細胞總RNA并測定其濃度,逆轉錄成cDNA后,分別應用mot-2、mdm2、 survivin、CD34和K5引物擴增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 五、Western blot 提取細胞總蛋白并測定濃度,用SDS-PAGE分離蛋白、半干法轉膜,用特異性一抗4℃孵育過夜,進一步常溫結合二抗1h后,用增強型化學發(fā)光法檢測相關蛋白表達及磷酸化水平。 六、Southwestern blot 提取細胞總蛋白,SDS-PAGE分離、半干法轉膜后,將膜變性、復性處理,用生物素標記的κB序列DNA探針與膜雜交,通過化學發(fā)光法檢測κB序列DNA與NF-κB的結合情況。 七、免疫共沉淀 提取細胞總蛋白,用IP抗體與蛋白混合過夜將靶蛋白沉淀后,用Western blot法檢測蛋白-蛋白相互作用或用Southwestern blot檢測DNA-蛋白相互作用。 八、免疫熒光法檢測p53的核轉位水平 將不同因素處理的HaCaT細胞用兔抗人p53一抗孵育24h后,用Cy3標記的山羊抗兔二抗孵育1h,用DAPI將細胞核染色15mmin后熒光顯微鏡下觀察p53的胞內分布以檢測p53的核轉位水平。 九、懸浮集落形成實驗 將1×104細胞接種至低吸附24孔板中,用含10ng/ml EGF和10ng/ml FGFβ的無血清DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng),每2天進行一次半定量換液,如此連續(xù)培養(yǎng)2周后,鏡下觀察拍照并計數。 結果 一、亞砷酸鈉對HaCaT細胞增殖和惡性轉化及DNA損傷和凋亡的影響 用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24h;分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細胞30代(約15周)。結果發(fā)現0.5、1.0和2.0μNaAsO2引起HaCaT細胞增殖升高,1.0μM NaAsO2引起增殖最明顯,并出現γ-H2AX水平輕度升高；而5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT細胞增殖降低、且γ-H2AX水平和斷裂caspase3水平均升高；1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細胞能在裸鼠皮下形成腫瘤,腫瘤組織病理學切片顯示為低分化上皮樣癌細胞。結果顯示NaAsO2在低濃度引起HaCaT細胞增殖和惡性轉化：而在高濃度則引起HaCaT細胞DNA損傷和細胞凋亡。 二、亞砷酸鈉對HaCaT細胞p53/survivin和MAPKs及NF-κB信號通路的影響 用0.0、1.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24h,結果發(fā)現1.0μMNaAsO2引起HaCaT細胞p-p53水平降低,而p-ERK、p-NF-κB/RelA、survivin和mot-2水平升高；5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT細胞p-JNK、p-p38和p-p53水平升高,而survivin水平降低。結果顯示NaAsO2在低濃度主要激活ERK和NF-κB信號通路、抑制p53功能而引起survivin和mot-2水平升高,而高濃度則主要激活JNK和p38信號通路、激活p53功能和引起survivin水平降低。 三、MAPKs和NF-κB信號通路在亞砷酸鈉對p53的影響中的作用 分別用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126、NF-κB抑制劑Bay11-7082、JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580處理HaCaT細胞6h后,再分別用0.0、1.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24h,結果發(fā)現阻滯ERK和NF-κB均使1.0μM NaAsO2所致HaCaT細胞p-p53降低回升,且阻滯ERK使1.0μMNaAsO2所致HaCaT細胞核內p53熒光強度降低回升；阻滯JNK則使10.0μMNaAsO2所致HaCaT細胞p-p53水平和核內p53熒光強度升高回降。結果顯示ERK和NF-κB信號通路主要參與低濃度NaAsO2所致細胞p53抑制過程,JNK信號通路則主要參與高濃度NaAsO2所致細胞p53激活過程。 四、ERK通過NF-κB調控mot-2和survivin在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細胞惡性轉化中的作用 用20.0nM NF-KB/RelA-siRNA和con-siRNA處理HaCaT細胞12h,或用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126處理HaCaT細胞6h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2處理HaCaT細胞24h,結果發(fā)現阻滯ERK信號通路可以阻止低濃度NaAsO2所致NF-κB與κB序列DNA結合能力；關閉NF-kB或抑制ERK均可使1.0μM NaAsO2所致HaCaT細胞mot-2和survivin的：mRNA和蛋白水平升高回降。結果顯示低濃度NaAsO2所致HaCaT細胞mot-2和survivin表達上調是通過ERK/NF-κB信號通路完成的。 分別用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126處理HaCaT細胞6h后,再用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24～48h,如此反復處理30代,結果發(fā)現阻滯ERK信號通路可阻止1.0μM NaAsO2慢性處理30代所致HaCaT細胞增殖升高、軟瓊脂上形成克隆形成和裸鼠皮下形成腫瘤。結果顯示ERK在低濃度NaAsO2所致HaCaT細胞增殖、惡性轉化和致瘤性中具有重要作用。 五、JNK通過p53調控survivin在高濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細胞DNA損傷和凋亡中的作用 分別用0.0和10.0μM JNK抑制劑SP600125處理HaCaT細胞6h后,再用0.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24h；發(fā)現阻滯JNK可抑制高濃度NaAsO2所致HaCaT細胞survivin mRNA和蛋白表達水平降低；發(fā)現高濃度NaAsO2使HaCaT細胞p53與JNK結合,而阻滯JNK后,p53主要與mdm2結合;10.0μM NaAsO2引起HaCaT細胞γ-H2AX水平和斷裂caspase3水平均升高;而用10.0μM NaAsO2聯合10.0μM SP600125處理HaCaT細胞γ-H2AX水平升高更多,而斷裂caspase3水平升高回降。結果顯示JNK通過激活p53而抑制survivin在高濃度NaAsO2所致HaCaT細胞DNA損傷和凋亡中具有重要作用。 六、低濃度亞砷酸鈉慢性處理誘導HaCaT細胞發(fā)生EMT和TSCs特性獲得 分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細胞30代后,結果發(fā)現1.0μMNaAsO2處理細胞20代時引起細胞形態(tài)發(fā)生間質樣改變：細胞粘附能力下降,上皮細胞指標E-cadherin水平降低,而間質細胞指標N-cadherin和vimentin水平以及干細胞表面抗原CD34和K5mRNA表達升高,細胞能夠形成懸浮細胞集落,且隨NaAsO2處理時間延長,上述改變越明顯。結果顯示低濃度NaAsO2慢性處理誘導HaCaT細胞發(fā)生EMT和獲得TSCs特性。 七、低濃度亞砷酸鈉慢性處理對HaCaT細胞NF-κB和snail的影響 分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細胞30代后,結果發(fā)現1.0μMNaAsO2處理細胞10代時,引起HaCaT細胞經典NF-κB信號通路的p-IKKβ、 p-IκBβ和p-NF-κB/RelA水平均升高,snail水平也升高,且隨NaAsO2處理時間延長,上述改變越明顯。結果顯示低濃度NaAsO2慢性處理HaCaT細胞可激活經典NF-κB信號通路,且上調snail水平。 八、NF-κB在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細胞snail升高中的作用 用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24或48h；用0.0和10.0μM NF-κB抑制劑Bay11-7082預處理HaCaT細胞6h或分別用20.0nM IKKβ-siRNA、 IKKa-siRNA或NF-κB/RelA-siRNA轉染HaCaT細胞12h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2處理HaCaT細胞24h,結果發(fā)現1.0μM NaAsO2急性處理引起HaCaT細胞snail水平升高,并具有一定的時間-效應關系；阻滯經典NF-κB信號通路可抑制1.0μM NaAsO2急性處理所致HaCaT細胞snail水平升高。結果顯示低濃度NaAsO2急性處理可通過經典NF-κB信號通路而引起snail水平升高。 九、NF-κB在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細胞EMT和TSCs特性獲得及致瘤性中的作用 分別用0.0和10.0μM NF-κB抑制劑Bayl1-7082預處理HaCaT細胞6h后,再分別用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細胞24～48h,如此重復處理30代。結果發(fā)現阻滯NF-κB可抑制1.0μM NaAsO2慢性處理所致HaCaT細胞E-cadherin水平和細胞粘附能力下降及N-cadherin、vimentin、CD34和K5水平升高,抑制細胞形態(tài)發(fā)生間質樣改變,抑制細胞懸浮集落形成能力和致瘤性。結果顯示NF-κB在低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細胞EMT和TSCs特性獲得及致瘤性過程中具有重要作用。 結論 1. NaAsO2在低濃度引起HaCaT細胞增殖和惡性轉化；而在高濃度則引起HaCaT細胞DNA損傷和細胞凋亡。 2.ERK激活NF-κB而抑制p53功能和引起survivin水平降低在低濃度NaAsO2所致HaCaT細胞增殖和惡性轉化過程中具有重要作用。 3.JNK激活p53功能而引起survivin水平升高在高濃度NaAsO2所致HaCaT細胞DNA損傷和凋亡中具有重要作用。 4.低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細胞惡性轉化過程中發(fā)生EMT和TSCs特性獲得。 5.經典NF-κB信號通路激活而引起snail水平升高在低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細胞EMT和TSCs特性獲得及惡性轉化過程中具有重要作用。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 董雪;李曉翠;史艷芬;范洪學;李榮貴;;亞砷酸鈉對上皮細胞向間充質細胞轉變過程的影響[J];中國老年學雜志;2011年01期

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本文編號：2452272