本文關(guān)鍵詞：氧化應激與神經(jīng)炎癥在1-溴丙烷致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用　出處：《山東大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究目的1-溴丙烷(1-Bromopropane,1-BP)是一種高揮發(fā)性有機化合物,在大氣中的半衰期約為15天,存在時間短。在中緯度地區(qū),1-BP臭氧消耗潛能(ozone depleting potential, ODP)較低約為0.013-0.018,故可作為臭氧消耗物質(zhì)(ozone-depleting solvents, ODS)如氯氟烴(chlorofluorocarbons, CFCs)和氫氯氟烴(hydrochlorofluorocarbons, HCFCs)的替代物使用。1-BP用于清洗金屬、塑料、電子和光學元件,還可作為脂肪、蠟和樹脂的溶劑,也是生產(chǎn)殺蟲劑、季胺類化合物、藥物和香料的中間產(chǎn)物。在人類病例和動物實驗中,1-BP均能夠引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system, PNS)感覺和運動障礙,以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)毒性如記憶損傷、疲勞和抑郁等。研究發(fā)現(xiàn)CNS癥狀的出現(xiàn)早于PNS,而且記憶損傷可以作為CNS毒性的指標并在動物實驗中可以通過Morris水迷宮進行準確測量。所以通過記憶損傷研究1-BPCNS毒性的劑量反應關(guān)系、可能涉及的毒性機制和生物標志物對于1-BP中毒的早預防、早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。對以記憶損傷為癥狀的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)和帕金森病(Parkinson's disease, PD)的研究發(fā)現(xiàn),氧化應激與記憶損傷可能具有病因?qū)W聯(lián)系。在CNS,谷胱甘肽(glutathione, GSH)是主要的抗氧化劑,對活性氧(reactive oxygen species, ROS)和外源化合物的解毒起到了重要的作用。因此,穩(wěn)定的GSH含量利于維持正常CNS功能,GSH耗竭可能導致記憶損傷。腦紅蛋白(neuroglobin, Ngb)是新發(fā)現(xiàn)的存在于大腦中的內(nèi)源性抗氧化劑,具有神經(jīng)保護作用,與認知功能密切相關(guān)。Ngb含量和神經(jīng)保護作用的發(fā)揮也依賴于細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。記憶功能依賴于神經(jīng)元的完整,記憶喪失往往伴隨著神經(jīng)元的損傷和丟失。神經(jīng)元的功能與星形膠質(zhì)細胞聯(lián)系緊密。氧化損傷能激活星形膠質(zhì)細胞,激活狀態(tài)的星形膠質(zhì)細胞會釋放炎性介質(zhì)和ROS作用于神經(jīng)元并最終導致神經(jīng)元的死亡。ROS、前炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)等都是星形膠質(zhì)細胞的激活劑。本課題使用0,100,200,400,800mg/kg bw 1-BP對大鼠進行染毒,觀察在1-BP致記憶損傷的過程中大腦皮層內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC)病理、Ngb含量、GSH代謝、星形膠質(zhì)細胞的變化及其與1-BP染毒劑量的關(guān)系,并通過基準劑量法尋找1-BPCNS毒性中較敏感的效應標志物,探討氧化應激和神經(jīng)炎癥在1-BP致CNS毒性中的作用。方法1.動物處理：雄性Wistar大鼠(180-220g)85只,經(jīng)5d適應性喂養(yǎng),大鼠被隨機分為5組(n=17),分別為對照組和1-BP染毒組(染毒劑量分別為100、200.400.800 mg/kg bw)。1-BP使用玉米油稀釋,大鼠經(jīng)灌胃連續(xù)給予1-BP 12d,對照組給予等體積玉米油,灌胃體積為0.2 ml/100g bw。實驗第13d斷頭處死大鼠(每組10只),迅速剝離大腦皮層,放于-80℃待測；每組7只大鼠進行心臟灌注,制備石蠟和冰凍切片。2.大鼠認知功能測定：染毒第8d至12d,大鼠進行Morris水迷宮測試。定位航行試驗中逃避潛伏期和游泳路程能夠表現(xiàn)大鼠學習能力,空間探索試驗中穿越平臺次數(shù)和目標象限時間百分比可以反映大鼠記憶能力。3.大鼠mPFC神經(jīng)元數(shù)量檢測：免疫組化染色檢測神經(jīng)元標志蛋白NeuN,選取mPFC邊緣前區(qū)(prelimbic area, PL)進行神經(jīng)元計數(shù)。4.大腦皮層氧化應激指標：試劑盒檢測GSH、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)活性；western blot檢測脂質(zhì)過氧化標志物,如4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)和n-epsilon-己酰-賴氨酸(n-epsilon-hexanoyl-lysine, HEL)的蛋白質(zhì)加合物；western blot檢測Ngb含量變化。5.大腦皮層星形膠質(zhì)細胞激活情況：免疫熒光檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein, GFAP)(激活的標志性蛋白)觀察大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的激活情況；western blot檢測GFAP蛋白含量。6.大腦皮層前炎性因子的測定：qRT-PCR檢測前炎性因子TNF-a的mRNA含量。7.基準劑量法計算效應標志物的基準劑量(benchmark dose, BMD)和BMD的可信限下限(BMD lower confidence limit, BMDL)。結(jié)果1.1-BP染毒大鼠出現(xiàn)認知功能障礙：水迷宮結(jié)果顯示,與對照組相比,200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠逃避潛伏期顯著增加、目標象限時間百分比顯著減少(p0.05,p0.01),400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠游泳路程顯著增加、穿越平臺次數(shù)顯著減少(p0.05,p0.01)。2.1-BP造成大鼠PL神經(jīng)元減少；與對照組相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠PL區(qū)域第5層神經(jīng)元數(shù)量呈劑量依賴性降低(p0.01),第2/3層和第6層無顯著變化。3.1-BP引起氧化應激：與對照組相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性顯著減少(p0.01),GSSG含量顯著增加(p0.01)；1-BP染毒大鼠大腦皮層4-HNE和HEL氧化修飾蛋白含量顯著增加(p0.01)；200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠大腦皮層Ngb含量呈劑量依賴性減少(p0.01)。4.1-BP導致大腦皮層星形膠質(zhì)細胞顯著激活：免疫熒光GFAP染色顯示星形膠質(zhì)細胞顯著激活；與對照組相比,1-BP染毒組大鼠大腦皮層GFAP蛋白含量顯著升高(p0.01)。5.1-BP引起前炎性因子TNF-a表達上調(diào)：qRT-PCR結(jié)果顯示1-BP染毒組大鼠大腦皮層TNF-a的mRNA水平顯著增加(p0.05)。6.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性較敏感的指標。行為學效應指標逃避潛伏期(第4d)、游泳路程(第4d)、目標象限時間百分比和穿越平臺次數(shù)的1-BP的BMDL分別為49.39、75.90、73.11和97.67 mg/kg.bw/day;生化效應指標大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性的1-BP的BMDL分別為59.61、23.40和64.85 mg/kg.bw/day。結(jié)論1.1-BP能夠引起大鼠學習記憶損傷,這可能與1-BP導致記憶功能的重要參與者mPFC的PL第5層神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)。2.1-BP能夠造成GSH耗竭、引起脂質(zhì)過氧化并降低對神經(jīng)元有保護作用的Ngb的含量。氧化損傷和神經(jīng)保護物質(zhì)的減少可能與神經(jīng)元丟失有關(guān)。3.1-BP引起星形膠質(zhì)細胞激活,前炎性因子TNF-a表達上調(diào)。神經(jīng)元丟失可能與激活的星形膠質(zhì)細胞釋放炎性介質(zhì)和ROS導致神經(jīng)元受損和死亡有關(guān)。4.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性較敏感的指標。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114

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