本文關(guān)鍵詞：異煙肼誘導(dǎo)家蠶脂肪體損傷及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

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【摘要】：結(jié)核病是危害人類健康的三大疾病之一,由于其高發(fā)性和高死亡性,成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題。異煙肼(INH)是治療結(jié)核病的首選藥物,然而長期和大量服用INH的患者會出現(xiàn)不同程度的肝損傷。為了深入探討INH類藥物的肝毒性機制,本文采用經(jīng)口暴露的方式,建立了INH對無脊椎動物家蠶脂肪體組織損傷模型,利用RNA-Seq技術(shù)比較分析了該模型基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,探討了對脂肪體代謝和功能的潛在影響。1 INH引起家蠶脂肪體出現(xiàn)類似哺乳動物肝毒性的損傷5齡第3 d的家蠶大造,經(jīng)口暴露INH(1000 mg/kg)后15min,高效液相色譜HPLC即可檢測到INH原藥在血淋巴、中腸和脂肪體的存在,組織間原藥的累積符合家蠶開放式循環(huán)系統(tǒng)特點。超氧化物歧化物(ROS)檢測發(fā)現(xiàn),INH處理組脂肪體和血淋巴中ROS水平明顯高于水處理對照組;HE和DAPI組織切片染色鑒定結(jié)果顯示,INH處理組脂肪體細(xì)胞中出現(xiàn)大量空泡,周圍存在很多破碎的細(xì)胞和受損的細(xì)胞核。隨著INH劑量的增加和處理后時間延長,家蠶血淋巴中與哺乳動物肝損傷相關(guān)的指標(biāo)性酶活性丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性顯著升高。表明家蠶在INH的作用下出現(xiàn)的脂肪體損傷與INH誘導(dǎo)哺乳動物的急性肝損傷具有相似性。2 INH誘導(dǎo)家蠶脂肪體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平改變經(jīng)口暴露1000 mg/kg(溶液體積100μL)INH后8 h,成功構(gòu)建兩個INH/CK家蠶脂肪體組織的RNA-Seq文庫,共獲得了10113功能基因,其中差異性表達(dá)基因2211,包括1908僅在處理組或?qū)φ战M特異性表達(dá)的基因,還有303個基因表達(dá)水平在處理組與對照之間顯著性差異。其中INH處理后出現(xiàn)表達(dá)的特異性表達(dá)基因652個,沉默的基因高達(dá)1264個,上調(diào)表達(dá)的基因85個,還有218個基因下調(diào)了表達(dá)水平。3 INH轉(zhuǎn)錄組文庫中差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路分析INH/CK兩個文庫相比,特異表達(dá)基因和差異表達(dá)基因的GO功能:生物過程(Biological Process)在三個GO功能分布中差異基因最多,主要存在與生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、定位、代謝過程、色素沉著等GO分支中;分子功能(Moleclur Function)中連接(binding)和催化(catalytic)兩個GO分支中差異基因占到該部分的差基因總數(shù)的90%;細(xì)胞成分(Cellular Component)中與細(xì)胞或生物膜有關(guān)的GO過程中也含有較多的差異基因。根據(jù)藥物代謝特點,將差異表達(dá)基因所有的KEGG通路總結(jié)為10大通路,其中在核損傷通路(46個)、細(xì)胞外信號通路(31個)、蛋白代謝通路(27個)、細(xì)胞過程(52個)凋亡通路(29個)等都含有較多的差異表達(dá)基因。在INH的藥物代謝KEGG通路中CYP4E3和GST的基因表達(dá)量發(fā)生變化,雌蠶和雄蠶脂肪體中GST活性顯著下調(diào)。與細(xì)胞凋亡有關(guān)通路:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成的信號通路中與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和結(jié)構(gòu)、糖基化修飾有關(guān)的基因發(fā)生了顯著性差異表達(dá),線粒體能量代謝通路中細(xì)胞色素C和AMPK基因也發(fā)生顯著性差異表達(dá)。INH影響線粒體呼吸鏈中復(fù)合物酶活性變化具有顯著地時間和劑量效應(yīng)。家蠶脂肪體中自噬基因Atg6和Atg8的表達(dá)量沒有上調(diào)表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：異煙肼 脂肪體損傷 差異表達(dá)基因 GO功能 KEGG通路
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-27
• 1 結(jié)核病研究現(xiàn)狀12-13
• 2 主治藥物異煙肼的研究進展13-14
• 3 藥物性肝損傷14-16
• 3.1 藥物性肝損傷機制14-15
• 3.2 肝損傷的酶指標(biāo)15-16
• 4 INH造成肝損傷的機制研究現(xiàn)狀16-22
• 4.1 INH抑制細(xì)胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)16
• 4.2 INH誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的兩大方式16-17
• 4.3 胞外凋亡信號通路： NF-kB17-19
• 4.4 胞內(nèi)細(xì)胞凋亡通路：線粒體調(diào)節(jié)的凋亡通路19-22
• 5 藥物肝毒性替代動物研究進展22-24
• 5.1 肝損傷動物模型及其替代研究發(fā)展趨勢22-23
• 5.2 以家蠶為模式動物的研究23
• 5.3 家蠶脂肪體與哺乳動物肝臟功能比較23-24
• 6 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)以及在毒理方面研究應(yīng)用24-27
• 6.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)的發(fā)展24-25
• 6.2 高通量測序技術(shù)有關(guān)毒理學(xué)研究的應(yīng)用25-27
• 第二章 研究內(nèi)容與方法27-38
• 1 研究目的和意義27
• 2 研究內(nèi)容27-28
• 3 技術(shù)路線28
• 4 試驗動物28-29
• 4.1 家蠶飼養(yǎng)方法28-29
• 4.2 供試實驗動物的處理29
• 4.3 家蠶給藥方式29
• 5 主要試劑29-30
• 6 主要儀器30-31
• 7 試驗方法31-38
• 7.1 高效液相色譜(HPLC)檢測INH條件31-32
• 7.2 家蠶脂肪體肝損傷指標(biāo)測定32
• 7.3 總RNA的抽提與反轉(zhuǎn)錄32-34
• 7.4 實時定量PCR（qRT-PCR）34-35
• 7.5 石蠟組織切片制備35-36
• 7.6 活性氧（ROS）檢測36
• 7.7 DAPI染色36-37
• 7.8 數(shù)字基因表達(dá)譜文庫構(gòu)建和測序數(shù)據(jù)分析37-38
• 第三章 結(jié)果與分析38-60
• 1 HPLC檢測INH經(jīng)口暴露后，在家蠶各組織中的分布38
• 2 INH經(jīng)口暴露誘導(dǎo)家蠶各組織活性氧水平提高38-39
• 3 INH對家蠶脂肪體組織造成的損傷39-40
• 4 肝損傷有關(guān)的酶活指標(biāo)的測定40-41
• 5 INH誘導(dǎo)家蠶脂肪體的轉(zhuǎn)錄組學(xué)文庫信息分析41-43
• 5.1 INH/CK兩個文庫質(zhì)量分析41-42
• 5.2 Clean reads注釋到NCBI的基因物種分布情況42-43
• 6 INH誘導(dǎo)家蠶脂肪體表達(dá)基因差異性分析43-48
• 6.1 INH/CK兩個DGE文庫中所有基因表達(dá)分析和Venn圖43-44
• 6.2 INH/CK兩個DGE文庫中特異性基因的GO功能分析44-46
• 6.3 INH/CK兩個DGE文庫中顯著性差異表達(dá)基因的GO功能分析46-47
• 6.4 INH/CK的差異表達(dá)基因的GO功能的量化分析47-48
• 7 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析48-57
• 7.1 歸類統(tǒng)計差異基因的KEGG通路48-51
• 7.2 基于DGE文庫篩選INH在家蠶脂肪體的藥物代謝通路51-52
• 7.3 基于DGE文庫篩選INH誘導(dǎo)家蠶脂肪體損傷的的信號通路52-57
• 8 差異基因的QRT-PCR驗證57-58
• 9 討論58-60
• 第四章 結(jié)論與展望60-62
• 1 綜合結(jié)論60-61
• 1.1 INH作用下家蠶脂肪體發(fā)生類似哺乳動物肝損傷的組織損傷60
• 1.2 INH干擾家蠶脂肪體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平60
• 1.3 INH作用下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路和線粒體能量代謝通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡60-61
• 2 后續(xù)研究展望與建議61-62
• 參考文獻(xiàn)62-75
• 附錄75-76
• 發(fā)表論文與參與項目76-78
• 致謝78-80

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 黃志君;曾文年;陳佩琳;鐘仰進;;家蠶變態(tài)期脂肪體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（2）[C];2009年

2 劉艷艷;池旭娟;闞雪芹;方向明;王海玲;劉文倩;蘇媚;談建中;;家蠶幼蟲期與蛹期脂肪體雌雄差異蛋白質(zhì)組的分析[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（2）[C];2009年

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4 _5清R[;劉芳;櫘慧;;蓖麻蠶在變態(tài)期脂肪體和血淋巴主要成分的變化[A];中國昆蟲學(xué)會1962年學(xué)術(shù)討論會會刊[C];1962年

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1 王海英;異煙肼誘導(dǎo)家蠶脂肪體損傷及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[D];蘇州大學(xué);2016年

2 葛君;有機磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后家蠶脂肪體特征蛋白及其基因的表達(dá)分析[D];蘇州大學(xué);2010年

3 程道軍;家蠶大規(guī)模EST測序及脂肪體基因表達(dá)譜分析[D];西南農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

4 郭旭;兩種新型家蠶凝集素基因的克隆及表達(dá)[D];華中師范大學(xué);2010年

5 李艷梅;重金屬鉛對家蠶的抗氧化和生殖發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)以及酶活性的影響[D];蘇州大學(xué);2011年

6 魯秀麗;沉默兩個基因?qū)煞N藥劑處理的褐飛虱生殖及脂肪體生化影響[D];揚州大學(xué);2015年

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本文編號：990976