本文關鍵詞：酸敏納米載體聯(lián)合傳輸辛伐他汀和nogginsiRNA協(xié)同促進MC3T3-E1細胞成骨分化基因調(diào)控的研究

  更多相關文章： 陽離子納米載體 pH敏感 聯(lián)合傳輸 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治療 骨缺損

【摘要】：研究背景骨缺損是臨床上常見的并發(fā)癥,也是臨床上較為棘手的問題,多由于創(chuàng)傷、感染及腫瘤切除后等因素所導致。骨不連引發(fā)的骨缺損多為原始創(chuàng)傷嚴重、急診處理不當引起,若伴有骨感染時治療會更為困難。臨床上多伴有肌肉萎縮、骨質疏松、關節(jié)僵硬等并發(fā)癥；其他并發(fā)癥如疼痛、肢體功能障礙等不僅給患者帶來了極大身體和心理上的負擔,同時也給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。由于創(chuàng)傷后部分骨缺損的治療效果欠佳,過去截肢常成為此類疾病的最終治療方式。大量松質骨移植對該病的治療是一個重大突破。骨搬運與骨牽引主要用于2-10cm骨缺損,但存在骨折對接部分延遲愈合,治療時間長等問題；游離骨皮瓣則用于5-12cm的缺損,常見的臨床并發(fā)癥為移植物不穩(wěn)和術后易再骨折。骨替代材料為另一個研究熱點,但仍不能達到治療創(chuàng)傷后部分骨缺損的目的。雖然傳統(tǒng)方法能在一定程度促進骨折的愈合,且獲得一定程度的成功,但治療操作難度較大,治療周期較長,需反復多次手術等并發(fā)癥限制了其廣泛應用。組織工程骨在解決移植骨的問題上是一個重大的突破。但就目前而言,尚無將組織工程骨成功轉化為自體骨的核心技術。所以必須尋找一種新的方法促進骨生成。BMP-2因能有效地促進骨折端的愈合而被廣泛應用于臨床,但存在需要量大,供應不足,本身制備困難,價格高昂等問題,嚴重限制了其臨床的廣泛應用。辛伐他汀為臨床上主要的調(diào)血脂的藥物,研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可促進成骨細胞表達BMP-2,進而促進骨折的愈合。但小分子的游離辛伐他汀應用存在水溶性低、易在肝臟代謝、穩(wěn)定性差、臨床應用劑量大和局部注射細胞毒性大等問題,也限制了其應用。RNAi技術自從其機制被發(fā)現(xiàn)以來,已被廣泛被沉默各種靶基因的的治療,具有廣闊應用前景。本課題也運用RNAi技術,通過下調(diào)noggin基因的表達,去除其抑制BMP-2的作用,從另一個方面促進MC3T3-E1細胞成骨。如何將小分子siRN A輸送到細胞也是現(xiàn)階段必須解決的問題,過去常運用病毒載體進行細胞轉染,結果表明病毒載體的細胞轉染效率雖高,但存在生物安全性問題。另外,siRNA分子在體內(nèi)應用時存在體內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定,容易被巨噬細胞吞噬、被核酸酶降解等問題,且分子量較大、本身帶有負電荷也使得其難以穿過帶同樣負電的細胞膜,不能發(fā)揮沉默目的基因的作用,故必須尋找一種新的有效的方式來促進其作用。本課題提出利用多功能納米藥物傳輸技術,索出一種臨床適用、安全經(jīng)濟的聯(lián)合重建成骨的治療方案。首先,根據(jù)辛伐他汀先誘導VEGF促進血管化再通過誘導BMPs促進成骨的順序作用機理,應用辛伐他汀促進植入骨的成骨；其次,利用RNA干擾技術下調(diào)BMPs的拮抗蛋白基因noggin的表達,辛伐他汀與noggin siRNA(針對noggin的siRNA)聯(lián)用,從而在BMP s轉錄和蛋白相互作用兩個水平同時促進骨生成。但siRNA和辛伐他汀直接用于治療存在給藥效率低和易降解的問題,也很難被共同傳輸?shù)焦切纬蓞^(qū)。因此,利用多功能納米載體將noggin siRNA和辛伐他汀同時靶向傳輸?shù)匠晒菂^(qū),促進成骨的發(fā)生,發(fā)揮其1+12的協(xié)同增效作用,同時也提高辛伐他汀的給藥效率,達到減少辛伐他汀劑量和避免可能的副作用。因此,本課題設計合成了一種新型的三元嵌段聚合物聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸(N,N-二異丙基乙二胺-芐胺){nPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)}的酸性敏感納米載體,可用于聯(lián)合傳輸辛伐他汀和noggin siRNA。從而可同時發(fā)揮藥物及基因治療的雙重效果。辛伐他汀作用于成骨細胞后會促進BMP-2的表達,而noggin作為BMP-2的特異性拮抗劑,會抑制BMP-2的促進成骨的作用。利用noggin siRNA可下調(diào)BMP-2誘導的noggin升高水平,將藥物治療和RNA干擾療法有機地結合起來,利用二者協(xié)同作用以達到促進成骨治療骨不連的目的。本文主要通過體外實驗來驗證酸敏響應性雙載體對MC3T3.E1細胞的作用,探討其在治療骨缺損方面的應用潛力。研究目的本文的研究目的為設計一種酸敏納米載體,對其結構和形狀進行表征,進一步研究其負載辛伐他汀和noggin siRNA的能力,空白納米載體對MC3T3-E1細胞的毒性作用,負載辛伐他汀的納米載體對MC3T3-E1細胞的增殖作用；同時研究其體外細胞內(nèi)吸收定位情況,進入細胞后的釋放情況；最后在基因、蛋白和堿性磷酸酶染色等方面研究納米載體同時負載辛伐他汀和siRNA對MC3T3-E1細胞的作用情況。研究方法1、化學方法合成聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),1H NMR核磁譜對聚合物進行測試表征；2、BI-200SM動態(tài)光散射系統(tǒng)(Brookhaven Instruments)對不同N/P比的納米載體復合物進行粒徑與Zeta電位測量,所得的每組樣品數(shù)據(jù),取5次測量的平均值；3、通過電鏡和繪制時間-累積釋放量圖分別驗證pH值為5.0和7.4時,在只負載辛伐他汀或同時負載辛伐他汀和siRNA的納米復合物中,辛伐他汀從納米載體中釋放的體外實驗；4、瓊脂糖凝膠實驗驗證不同N/P比納米載體與noggin siRNA的復合情況,按照納米載體是否負載辛伐他汀將其分為兩組；5、Cell Counting Kit-8法(CCK8法)檢測不同濃度無負載辛伐他汀納米載體(B-mPB P)對MC3T3-E1細胞的毒性作用；CCK8法檢測游離不同濃度辛伐他汀和負載辛伐他汀納米載體(D-mPBP) 對 MC3T3-E1細胞增殖的影響；6、應用激光共聚焦(CLSM)定性和流式細胞術定量分析檢測納米載體的細胞內(nèi)吸收情況；7、Real-time PCR實驗驗證D-mPBP中不同濃度辛伐他汀和當濃度luM時,不同作用時間對noggin及BMP-2基因表達的影響：D-mPBP中辛伐他汀濃度為10uM時,不同濃度noggin siRNA 對 noggin及BMP-2基因表達的影響；8、Real-time PCR實驗驗證noggin siRNA濃度為120nnM時,D-mPBP中辛伐他汀濃度為1,10 uM時,noggin及BMP-2基因表達情況,同時用Western blotting實驗、堿性磷酸酶和茜素紅成骨染色進一步驗證；結果1、成功合成了聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),'H NMR核磁譜圖顯示聚合物被成功合成：2、通過動態(tài)光散射系統(tǒng)對不同N/P比的D-mPBP/siRN A納米載體復合物進行粒徑和表面電位測定。當N/P=10時,納米載體復合物具有相對較小粒徑(40nm)和較弱的表面正電荷(+8mV)。因此,當納米載體復合物的N/P為10時,其具有較高的細胞轉染效率；3、透射電鏡表征和辛伐他汀體外釋放實驗表明在pH 7.4時,粒徑較為均勻、分布在40 nm左右,此時藥物呈緩慢釋放狀態(tài)；當pH 5.0時,膠束膨大聚集,表現(xiàn)出快速釋放行為；4、瓊脂糖凝膠阻滯實驗結果：當N/P比為10時,siRNA被完全復合而無條帶跑出,陽離子納米載體無論是否負載辛伐他汀都不會影響其負載siRNA的能力；5、CCK8法驗證空白納米載體細胞毒性實驗：以N/P=10與siRNA進行復合時,當空白納米載體的濃度高達430 ug/mL時,MC3T3-E1細胞的存活率仍高達90.5%,此時納米載體復合了siRNA,中和了一部分正電,從而降低了其對細胞的毒性作用；6、不同濃度的游離辛伐他汀對細胞并無毒性或增殖作用；負載辛伐他汀的納米載體對細胞增值有一定作用,但當濃度為10uM時卻抑制細胞的增殖；7、激光共聚焦實驗及流式細胞技術結果：證實納米載體復合物能被MC3T3-E1細胞高效內(nèi)吞,轉染率高達86.4%,進入細胞溶酶體后藥物緩慢釋放,結果顯示納米載體復合物是緩慢進入細胞的,10min時部分進入細胞,30min時進入更多,到60min時已大部分進入并開始釋放分離,120min時基本完全釋放；8、熒光定量PCR結果：納米載體負載辛伐他汀的濃度為1 uM時的作用效果最好,且最佳作用時間為48h；當noggin siRN A的濃度越高,對noggin的抑制作用越好,當高達為120 nM時,對noggin的抑制作用最好；9、當noggin siRNA濃度為120nM時,辛伐他汀的濃度為1uM時的作用效果最佳。結果得到了Western blotting實驗、堿性磷酸酶和茜素紅染色結果進一步驗證。結論本文主要通過體外實驗來探討酸敏響應性雙載體在治療骨缺損方面的應用潛力。本課題成功合成了聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸(N,N二異丙基乙二胺-芐胺)(mPEG-g-bPEI-g-PAsp (DIP-BA))的酸性敏感納米載體,運用透射電鏡、粒徑電位儀等測試了聚合物納米載體的形貌和粒徑,實驗結果表明,我們成功制備了粒徑較小、分布均勻的具有酸敏內(nèi)核的納米載體,其粒徑約為40nm,可以避免其快速地被腎臟排除和被RES攝取。從另一方面也增加了藥物的水溶性、延長了藥物的血液循環(huán)時間以及改善治療效果。生物學實驗結果強有力地證明：應用pH敏感性陽離子納米載體協(xié)同運輸辛伐他汀和noggin siRNA能夠協(xié)同促進細胞成骨發(fā)生。這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在辛伐他汀誘導BMP-2的表達,從而引發(fā)的noggin的上調(diào)可被同時運輸?shù)膎ogginsiRNA有效地降低,從而降低了noggin抑制成骨的作用,二者協(xié)同更好地促進了成骨的發(fā)生。結果進一步表明酸敏納米雙載體為骨組織工程的發(fā)展和骨缺損的治療提供了一個新的思路,我們將進一步通體內(nèi)實驗進行驗證。
【關鍵詞】：陽離子納米載體 pH敏感 聯(lián)合傳輸 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治療 骨缺損
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 前言16-29
• 1.1 骨缺損的治療16-18
• 1.2. BMPs在促成骨中的應用18-19
• 1.3 辛伐他汀在促成骨中的應用19-20
• 1.4 Noggin基因和RNA干擾技術研究進展20-21
• 1.5 藥物傳輸納米載體的研究現(xiàn)狀21-22
• 1.6 課題的提出和創(chuàng)新點22-23
• 參考文獻23-29
• 第二章 pH敏感納米載體聯(lián)合傳輸noggin siRNA和辛伐他汀促進MC3T3-E1細胞成骨分化基因調(diào)控的研究29-69
• 2.1 引言29-32
• 2.2 實驗材料與方法32-37
• 2.3 實驗方法37-47
• 2.4 結果47-62
• 2.5 討論62-64
• 2.6 小結64
• 參考文獻64-69
• 在職期間學術成果69-70
• 致謝70-72

【共引文獻】

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本文編號：955118