本文關(guān)鍵詞：膽堿能抗炎通路功能的晝夜節(jié)律性研究

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【摘要】：炎癥是生命過程中常見而且重要的基本病理過程,凡是具有血管系統(tǒng)的活體組織在外部或內(nèi)源性損傷因子的刺激下產(chǎn)生的防御性反應(yīng)統(tǒng)稱為炎癥,在一定情況下,炎癥又可以誘導(dǎo)一些疾病,如腦部的炎癥容易壓迫中樞神經(jīng)、心肌炎在嚴(yán)重的情況下影響心臟的功能、過于劇烈的超敏反應(yīng)甚至能威脅生命。臨床上多種慢性疾病的癥狀表現(xiàn)出晝夜節(jié)律,如心肌梗死(Myocardial infarction,MI)患者早晨的發(fā)病率更高;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(Rheumatoid arthritis,RA)表現(xiàn)為早晨關(guān)節(jié)僵硬。而時(shí)辰藥理學(xué)(Chronopharmacology)作為藥理學(xué)與時(shí)間生物學(xué)的交叉學(xué)科,雖然很早就被臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)到有助于改善常規(guī)治療的療效并能降低副作用并發(fā)展成為時(shí)辰療法(Chronotherapy),但是目前為止被臨床認(rèn)可的時(shí)辰療法并不多,主要原因是現(xiàn)有的時(shí)辰療法只能部分改善治療效果而不能實(shí)質(zhì)性地治愈疾病,所以投入的研究資源很少。因此,對(duì)于炎癥性疾病的時(shí)辰療法還有很大的研究空間。膽堿能抗炎通路是指迷走神經(jīng)釋放的遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)由細(xì)胞膜尼古丁α7受體(α7-nicotinic acetylcholine receptor,α7-n ACh R)介導(dǎo),可以有效抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度,是一條神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)全身炎癥調(diào)控的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路。該通路最早在Nature由Borovikova發(fā)表,本實(shí)驗(yàn)室在后期也利用該通路對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、心肌梗死(myocardial infarction,MI)等疾病的機(jī)制做了大量的研究工作,證明了該通路在相關(guān)疾病中起到的作用,并提出了很多新穎的觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室具備全自動(dòng)時(shí)間節(jié)律動(dòng)物飼養(yǎng)室,所以我們把膽堿能抗炎通路與晝夜節(jié)律的相關(guān)知識(shí)聯(lián)系了起來(lái)。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)關(guān)于膽堿能抗炎通路的抗炎功能是否有晝夜節(jié)律性的研究從未有過報(bào)道,那么該通路的抗炎功能是否有晝夜節(jié)律性呢?如果證明了這個(gè)假設(shè)是否可以為臨床治療提供新的思路呢?本課題以α7-n ACh R為中心,試圖驗(yàn)證膽堿能抗炎通路是否有抗炎功能;證明其功能是否存在晝夜節(jié)律性;確定該通路與皮質(zhì)醇(Cortisol)的抗炎節(jié)律的關(guān)系。根據(jù)這些假設(shè),我們?cè)O(shè)計(jì)了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:實(shí)驗(yàn)一:膽堿能抗炎通路有明顯的抗炎作用利用特異性阻斷劑米非司酮(Mifepristone)和甲基牛扁堿(Methyllycaconitine,MLA)分別阻斷糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptors,GR)和α7-n ACh R后用低濃度的內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,LPS)造模,與對(duì)照組相比,兩個(gè)受體分別阻斷后,炎癥因子(IL-1β,TNFαand IL-6)的表達(dá)明顯升高,Mifepristone組的結(jié)果升高更明顯。實(shí)驗(yàn)二:糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids,GCs)和泡狀乙酰膽堿轉(zhuǎn)移體(Vesicular acetylcholine transporter,VACh T)的表達(dá)有晝夜節(jié)律性,膽堿能抗炎通路的抗炎節(jié)律可能和皮質(zhì)醇的抗炎節(jié)律呈互補(bǔ)關(guān)系將正常小鼠分成8個(gè)組,每隔3h檢測(cè)其中一組血清內(nèi)GCs的濃度,我們發(fā)現(xiàn)GCs的濃度晝夜間是有差異的,0點(diǎn)最高,值為382.9 ng/ml(n=7,p0.05),15點(diǎn)最低,值為69.5 ng/ml(n=7,p0.05)。肝臟和腎臟內(nèi)VACh T的WB結(jié)果顯示其表達(dá)節(jié)律與皮質(zhì)醇相反,在活躍期表達(dá)相對(duì)較少,在靜止期表達(dá)量相對(duì)較多。實(shí)驗(yàn)三:炎癥因子的表達(dá)呈晝夜節(jié)律變化將正常小鼠分成8個(gè)組,每隔3h用低濃度LPS造模,我們發(fā)現(xiàn),三種炎癥因子(IL-1β,TNFαand IL-6)的表達(dá)節(jié)律組間有相似的變化,且節(jié)律與GCs的分泌節(jié)律呈明顯的反比關(guān)系,在靜止期高,最高點(diǎn)在15點(diǎn),活躍期低,最低點(diǎn)在6點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)四:毒膿血癥模型小鼠的生存率存在晝夜節(jié)律變化將正常小鼠分成8個(gè)組,每隔3h用高濃度的LPS造模,觀察72h。我們發(fā)現(xiàn)活躍期(21點(diǎn)、0點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)、)造模的小鼠平均生存率明顯高于靜止期(9點(diǎn)、12點(diǎn)、15點(diǎn)、18點(diǎn))造模的小鼠。其中15:00與3:00比較(χ2=7.428,P=0.006),有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)五:膽堿能抗炎通路抗炎作用不能夠改變炎癥因子的表達(dá)節(jié)律將正常小鼠隨即分成8組,在3點(diǎn)對(duì)其中4組小鼠分別腹腔注射丙二醇、Mifepristone(40mg/kg)、MLA(10mg/kg)以及兩藥合用后,用低濃度LPS造模,15點(diǎn)以同樣的方法對(duì)另外4組造模。我們發(fā)現(xiàn)在炎癥狀態(tài)下,各組炎癥因子的表達(dá)趨勢(shì)在靜止期都高于活躍期;MLA組與對(duì)照組相比,IL-6的表達(dá)在活躍期和靜止期都升高,有顯著性差異(P0.05);Mifepriston組與對(duì)照組相比,各炎癥因子的表達(dá)在兩個(gè)階段都顯著升高,TNF-α和IL-6靜止期相對(duì)于活躍期的表達(dá)差異消失,IL-1β在兩個(gè)階段的結(jié)果有顯著性差異(P0.05);MLA+Mifepriston組與對(duì)照組相比,各炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步提高,TNF-α、IL-6的結(jié)果顯示兩個(gè)階段的晝夜差異消失,IL-1β的結(jié)果顯示靜止期高于活躍期的節(jié)律,結(jié)果有顯著性差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)六:膽堿能抗炎通路的功能不足以改變毒膿血癥模型小鼠的生存率的晝夜差異對(duì)照組為機(jī)體抗炎功能正常的情況下,毒膿血癥模型小鼠的生存率活躍期高于靜止期(χ2=4.041,P=0.044);MLA組與對(duì)照組相比,小鼠在兩個(gè)時(shí)間段的生存率都降低,活躍期仍高于靜止期(χ2=5.520,P=0.019);Mifepristone組和MLA+Mifepriston小鼠與對(duì)照組相比,在兩個(gè)階段的生存率與對(duì)照組相比均急劇下降,但相同給藥組活躍期和靜止期之間沒有顯著性差異。結(jié)論:1、皮質(zhì)醇和膽堿能抗炎通路在體內(nèi)的抗炎機(jī)制中都起著很重要的作用。2、膽堿能抗炎通路的抗炎功能弱于皮質(zhì)醇,在皮質(zhì)醇的抗炎功能被抑制后,膽堿能抗炎功能不能夠改變本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈髾C(jī)體整體的抗炎節(jié)律,不能改變機(jī)體炎癥反應(yīng)的結(jié)局,沒有明顯的晝夜節(jié)律性。3、機(jī)體在皮質(zhì)醇和膽堿能抗炎通路外還存在其他的抗炎機(jī)制,其整體的晝夜節(jié)律性與皮質(zhì)醇的抗炎節(jié)律相同。
【關(guān)鍵詞】：膽堿能抗炎通路 晝夜節(jié)律 炎癥 時(shí)辰藥理學(xué) 皮質(zhì)醇 內(nèi)毒素血癥
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-17
• 第一部分 GCs和膽堿能抗炎通路的抗炎作用17-25
• 材料與方法17-23
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-24
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)24-25
• 第二部分 機(jī)體炎癥反應(yīng)規(guī)律、ACh以及GCs表達(dá)的晝夜節(jié)律性25-40
• 材料與方法25-34
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-39
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)39-40
• 第三部分 膽堿能抗炎功能是否存在晝夜節(jié)律性,與GCs的關(guān)系40-45
• 材料與方法40-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-44
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)44-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述54-62
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 在讀期間發(fā)表論文情況62
• 參加科研工作情況62-63
• 致謝63-64

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：678817