本文關(guān)鍵詞：表達(dá)HSA-IFNα2b的CHO細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建及其無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)化

  更多相關(guān)文章： 人血清白蛋白 干擾素α2b 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基 丁酸鈉

【摘要】：干擾素α2b(Interferonα2b,IFNα2b)是一種用于病毒性疾病和腫瘤性疾病治療的多功能細(xì)胞因子,因其在體內(nèi)的半衰期短從而限制其在臨床上的應(yīng)用。本研究室已成功構(gòu)建人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)融合蛋白長(zhǎng)效藥物開(kāi)發(fā)平臺(tái),將HSA與IFNα2b的N端(HSA-IFNα2b)融合并在畢赤酵母中成功表達(dá)。HSA-IFNα2b具有較好活性,但在畢赤酵母中表達(dá)融合蛋白時(shí),存在融合蛋白不穩(wěn)定、容易降解、產(chǎn)物不均一等問(wèn)題。目前,中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白免疫原性低、人體相容性好、活性高。本課題將已經(jīng)在畢赤酵母中表達(dá)HSA-IFNα2b的重組蛋白在高級(jí)表達(dá)系統(tǒng)CHO中進(jìn)行表達(dá)制備,優(yōu)化CHO發(fā)酵培養(yǎng)基并放大培養(yǎng)。本研究將IFNα2b連接到HSA的C端,構(gòu)建融合蛋白HSA-IFNα2b。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pMH3/HSA-IFNa2b,電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中。經(jīng)G418的抗性壓力篩選和目的蛋白的表達(dá)量篩選,最終獲得一株高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株(CHO/pMH3/HSA-IFNa2b)。表達(dá)的目的蛋白經(jīng)Western Blot驗(yàn)證顯示,產(chǎn)物具有IFNα2b和HSA的雙抗原性。經(jīng)懸浮馴化穩(wěn)定后,通過(guò)批次篩選得到一株穩(wěn)定的高克隆表達(dá)株,產(chǎn)量約為31 mg/L。重組細(xì)胞株的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同代數(shù)之間蛋白的表達(dá)量和生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯的差異。最終,獲得一株能懸浮培養(yǎng)、穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。為篩選獲得最優(yōu)的懸浮培養(yǎng)基,本研究選擇十七種商業(yè)化無(wú)血清培養(yǎng)基,快速篩選得到生長(zhǎng)和表達(dá)良好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)和流加培養(yǎng)基(F4)。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基,通過(guò)在培養(yǎng)基中添加功能性添加因子丁酸鈉、亞油酸、乙醇胺、蘇拉明。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)基中添加丁酸鈉作為培養(yǎng)基的添加因子,獲得高表達(dá)的個(gè)性化無(wú)血清培養(yǎng)基。重組細(xì)胞株在BM中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)8×106 cells/m L,繼續(xù)補(bǔ)加F4可以支持細(xì)胞批次培養(yǎng)超過(guò)10×106 cells/mL,同時(shí)在500 m L搖瓶中培養(yǎng)時(shí)間至10 d,融合蛋白表達(dá)量達(dá)到61.5 mg/L。通過(guò)添加的2 mM丁酸鈉,融合蛋白表達(dá)增長(zhǎng)至81 mg/L。進(jìn)一步考察添加丁酸鈉的過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝情況,結(jié)果顯示:丁酸鈉添加后24 h細(xì)胞處于G1期比例由41%升高到62.9%,同時(shí)提高融合蛋白HSA-IFNα2b mRNA的表達(dá)高達(dá)2.6倍,并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝無(wú)明顯影響。最后,在3 L搖瓶中進(jìn)行了流加培養(yǎng),并在5 L的AP-20一次性生物反應(yīng)器上進(jìn)行通氣與攪拌方面工藝的初步摸索,在反應(yīng)器上得到與搖瓶中相對(duì)一致的培養(yǎng)效果,融合蛋白表達(dá)量達(dá)到137 mg/L,實(shí)現(xiàn)了從搖瓶到反應(yīng)器的工藝放大。離心獲得發(fā)酵上清液后,依次通過(guò)藍(lán)色親和染料層析、疏水層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,獲得的融合蛋白HSA-IFNα2b純度96.8%,目的蛋白的總回收率為22.3%。對(duì)純化后融合蛋白的活性進(jìn)行檢測(cè),比活性為4.16×106 IU/mg,與畢赤酵母表達(dá)融合蛋白HSA-IFNα2b的生物活性水平基本相當(dāng)。
【關(guān)鍵詞】：人血清白蛋白 干擾素α2b 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基 丁酸鈉
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 長(zhǎng)效干擾素的研究9-11
• 1.1.1 干擾素簡(jiǎn)介9
• 1.1.2 長(zhǎng)效干擾素的研究9-11
• 1.2 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的概述11-13
• 1.2.1 不同表達(dá)系統(tǒng)的研究11-12
• 1.2.2 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)12
• 1.2.3 高效穩(wěn)定的CHO表達(dá)系統(tǒng)策略的建立12-13
• 1.3 無(wú)血清培養(yǎng)基的研究13-16
• 1.3.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展過(guò)程13
• 1.3.2 無(wú)血清培養(yǎng)基中的添加因子13-14
• 1.3.3 無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)化以及個(gè)性化14-15
• 1.3.4 無(wú)血清培養(yǎng)基的懸浮適應(yīng)15-16
• 1.4 細(xì)胞培養(yǎng)工藝的研究16-17
• 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)的模式16-17
• 1.4.2 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)17
• 1.5 立題意義和研究?jī)?nèi)容17-19
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法19-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 菌株、細(xì)胞株、質(zhì)粒及引物19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 2.1.3 儀器設(shè)備20-21
• 2.1.4 培養(yǎng)基及溶液配制21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 2.2.1 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)與保種21-22
• 2.2.2 CHO重組細(xì)胞的構(gòu)建22-23
• 2.2.3 重組細(xì)胞的構(gòu)建與篩選23-24
• 2.2.4 細(xì)胞的懸浮馴化24
• 2.2.5 細(xì)胞批次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.2.6 細(xì)胞穩(wěn)定性驗(yàn)證25
• 2.2.7 蛋白檢測(cè)方法25-26
• 2.2.8 基礎(chǔ)培養(yǎng)基批次篩選26
• 2.2.9 流加培養(yǎng)基篩選實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.10 特殊因子的添加以及丁酸鈉的流加培養(yǎng)26
• 2.2.11 細(xì)胞周期測(cè)定26
• 2.2.12 RNA提取和熒光定量PCR26-27
• 2.2.13 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生化指標(biāo)測(cè)定27
• 2.2.14 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)27
• 2.2.15 使用AP-20 一次性生物反應(yīng)器 5 L流加培養(yǎng)27
• 2.2.16 融合蛋白的純化27-28
• 2.2.17 純化樣品純度檢測(cè)28
• 2.2.18 純化樣品的生物活性檢測(cè)28-29
• 第三章 結(jié)果與討論29-46
• 3.1 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建29
• 3.2 重組CHO細(xì)胞的構(gòu)建與篩選29-32
• 3.2.1 CHO細(xì)胞株的構(gòu)建及高克隆篩選29-31
• 3.2.2 重組CHO細(xì)胞懸浮馴化和批次實(shí)驗(yàn)31
• 3.2.3 重組細(xì)胞穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)31-32
• 3.3 無(wú)血清培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化32-39
• 3.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初篩和混合測(cè)試32-34
• 3.3.2 流加培養(yǎng)基篩選34-35
• 3.3.3 特殊因子的添加對(duì)細(xì)胞影響35-36
• 3.3.4 丁酸鈉的添加對(duì)細(xì)胞影響36-39
• 3.4 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)和 5 L一次性生物反應(yīng)器的流加培養(yǎng)39-41
• 3.4.1 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)39-40
• 3.4.2 AP-20 一次性 5 L激流生物反應(yīng)器流加培養(yǎng)40-41
• 3.5 HSA-IFNα2b的分離純化41-43
• 3.5.1 Blue Sepharose FF親和層析41-42
• 3.5.2 Phenyl Sepharose FF疏水層析42-43
• 3.6 HSA-IFNα2b的檢測(cè)43-46
• 3.6.1 純化樣品純度檢測(cè)43-44
• 3.6.2 純化后樣品Western Blot驗(yàn)證44
• 3.6.3 純化樣品生物活性檢測(cè)44-45
• 3.6.4 純化樣品分子量檢測(cè)45-46
• 第四章 主要結(jié)論與展望46-47
• 4.1 主要結(jié)論46
• 4.2 下一步研究工作展望46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文52

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的一種無(wú)血清培養(yǎng)基[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1995年06期

2 楊鳳鐸;李明;董春柳;;無(wú)血清培養(yǎng)基概述及應(yīng)用前景[J];科技視界;2012年36期

3 馮根生;;用無(wú)血清培養(yǎng)基生產(chǎn)人γ干擾素[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).生物制品分冊(cè);1984年02期

4 陳斌朝;用無(wú)血清培養(yǎng)基生產(chǎn)白細(xì)胞介素2[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1986年02期

5 梁菁;李多偉;;無(wú)血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展[J];西北藥學(xué)雜志;2009年04期

6 李忠明;陳秀英;章谷生;史良如;;無(wú)血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).生物制品分冊(cè);1984年05期

7 辛國(guó)華,陳國(guó)安,蘇子毅,曹勇,戴育成,李國(guó)輝,吳燮卿;人表皮細(xì)胞在三種無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)與增殖[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年01期

8 鄧遠(yuǎn)運(yùn);用無(wú)血清培養(yǎng)基初代培養(yǎng)人二倍體成纖維細(xì)胞[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1986年06期

9 何長(zhǎng)民;在無(wú)血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)單克隆抗體[J];微生物學(xué)免疫學(xué)譯刊;1982年02期

10 李黎,蔡宏榮,張和君,郭仁,董德祥;無(wú)血清培養(yǎng)基在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1990年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 陳曲侯;洪華珠;余澤華;;一種新的無(wú)血清培養(yǎng)基[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

2 朱一蓓;席泓;古濤;戴俊;於葛華;王金香;張學(xué)光;;無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)DC體外誘導(dǎo)的影響的研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 生物通;Invitrogen公司推出間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳飛;DHFR-CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基及其關(guān)鍵組份的研究和應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 段盼盼;Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研制及其在流感病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

2 李在晗;Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基篩選及其培養(yǎng)H5N1亞型流感病毒的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

3 李成媛;表達(dá)HSA-IFNα2b的CHO細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建及其無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)化[D];江南大學(xué);2016年

4 黃錠;用于流感疫苗生產(chǎn)的MDCK細(xì)胞無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的開(kāi)發(fā)[D];華東理工大學(xué);2010年

5 郭紀(jì)元;CHO DG44穩(wěn)定細(xì)胞株無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)與優(yōu)化[D];廈門大學(xué);2014年

6 趙逸超;肝細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

7 李曉璐;CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的高通量篩選與優(yōu)化[D];華東理工大學(xué);2012年

8 俞錦鋒;基于Tubespin生物反應(yīng)器的CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的高通量篩選與優(yōu)化[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2013年

9 賈涵婧;用于流感疫苗生產(chǎn)的MDCK懸浮細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)[D];華東理工大學(xué);2015年

10 唐家明;鐵對(duì)Caco-2細(xì)胞及肉仔雞錳吸收的影響及其機(jī)制[D];河北科技師范學(xué)院;2015年

，

本文編號(hào)：613321