本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌Sortase A小分子抑制劑的研究

  更多相關(guān)文章： 金黃色葡萄球菌 SrtA轉(zhuǎn)肽酶 致病性 共價抑制劑

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)能夠引起局部組織化膿感染、肺炎、敗血癥等疾病,嚴重威脅著人類的身體健康。近年來,由于抗生素的大量使用甚至濫用,使得醫(yī)院和社區(qū)中出現(xiàn)了大量的耐藥病原菌,如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant S.aureus,MRSA)和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin Resistant S.aureus,VRSA)。目前,細菌的耐藥性已經(jīng)成為日益嚴峻的全球性公共衛(wèi)生問題,對于抗菌感染新類型藥物的研發(fā)已經(jīng)刻不容緩�？股刂饕ㄟ^殺菌或抑制細菌生長來達到治療細菌感染的效果,但同時也會影響宿主體內(nèi)的益生菌的生存狀態(tài),破壞體內(nèi)的微生態(tài)平衡,從而產(chǎn)生對宿主有害的副作用。近年來,抗毒力治療(Anti-virulence therapies)作為新型抗細菌感染的策略,可以通過干預(yù)細菌的致病能力而非直接殺死細菌來達到治療效果,是目前抗細菌感染藥物研究的前沿?zé)狳c。在革蘭氏陽性菌內(nèi),轉(zhuǎn)肽酶Sortase A(SrtA)主要負責(zé)將20多種表面毒力因子蛋白錨定到細菌的細胞壁上。據(jù)報道srtA基因與革蘭氏陽性菌的致病力密切相關(guān),但其并不是細菌生存與生長所必需的。因此抑制SrtA的活性不會對病原菌帶來生存壓力,并且在臨床上也可能會降低針對抑制SrtA轉(zhuǎn)肽活性的耐藥性菌株出現(xiàn)的機率。綜上所述,S.aureus SrtA(SaSrtA)是抗細菌毒力因子潛在的藥物作用候選靶標。合作實驗室以Pyranonaphthoquinone類天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中參與生物還原烷基化過程的苯醌并吡喃內(nèi)酯類三環(huán)為關(guān)鍵母核骨架,對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,合成了大約200個化合物。本論文利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)構(gòu)建SaSrtA小分子抑制劑的篩選體系,針對這200個化合物篩選能夠干預(yù)SaSrtA轉(zhuǎn)肽反應(yīng)活性的小分子抑制劑,最終我們得到了16個具有較好抑制活性的化合物,IC_(50)在2-80μM之間�；诨衔锏睦砘再|(zhì)和抑制活性考慮,對化合物SOMCL-14-283及其相差異構(gòu)體SOMCL-14-284開展進一步的體外研究:(1)SDS-PAGE的轉(zhuǎn)肽實驗結(jié)果顯示兩個化合物均抑制SaSrtA對底物蛋白質(zhì)(Sa IsdA)的轉(zhuǎn)肽活性,并且化合物SOMCL-14-283的抑制活性比SOMCL-14-284的活性提高3倍左右,這與通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移測得的IC_(50)具有一致性;(2)質(zhì)譜結(jié)果顯示,化合物SOMCL-14-283不可逆共價修飾SaSrtA的Cys184位點。(3)圓二色譜(CD)揭示SOMCL-14-283在最高濃度為400μM時對SaSrtA蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。隨后,細菌細胞上,利用FITC-IGg和western blot的技術(shù)檢測細胞壁SpA的含量,發(fā)現(xiàn)可以顯著降低金黃色葡萄球菌細胞壁SpA的錨定量。在150μM濃度下,兩個化合物對金黃色葡萄球菌的生長幾乎沒有影響以及MIC值也均大于200μM。此外,我們發(fā)現(xiàn)SOMCL-14-283還具有抑制廣譜革蘭氏陽性菌SrtA的活性。本論文以發(fā)現(xiàn)新靶標和新機制的新型抗菌感染活性化合物為目標,針對與致病力密切相關(guān)的SrtA進行高通量篩選評價以及結(jié)構(gòu)改造的合作研究,發(fā)現(xiàn)了具有明確抑制SrtA活性的化合物SOMCL-14-283,并進一步研究了其抑制SaSrtA活性的分子機制。因此,本研究為開發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用機制不同的新型抗菌藥物提供了有意義的嘗試以及為SrtA共價抑制劑的設(shè)計與篩選提供了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 SrtA轉(zhuǎn)肽酶 致病性 共價抑制劑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院上海藥物研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-31
• 1.1 金黃色葡萄球菌感染現(xiàn)狀13-16
• 1.1.1 病原菌耐藥形勢迫切需要抗菌新藥研發(fā)13-14
• 1.1.2 抗生素研發(fā)歷史進程和未來趨勢14-15
• 1.1.3 基于抗-致病力（Anti-virulence）策略的抗菌藥物研發(fā)成為熱點15-16
• 1.2 SaSrtA是一個理想的抗致病力的靶標16-18
• 1.3 SaSrtA的結(jié)構(gòu)18-20
• 1.4 SaSrtA的抑制劑研究進展20-31
• 1.4.1 Diarylacrylonitriles21-22
• 1.4.2 Aryl( β-amino )ethyl Ketones22-23
• 1.4.3 Rhodanines、Pyridazinones和Pyrazolethiones23-25
• 1.4.4 Morpholinobenzoate衍生物25-26
• 1.4.5 Dihydro-β-carboline26-27
• 1.4.6 Benzo[d]isothiazol-3(2H)-one-adamantane衍生物27-28
• 1.4.7 綠原酸（CHA）和櫟素（QEN）28-29
• 1.4.8 3,6-Disubstituted Triazolothiazoles29-31
• 第二章 實驗材料和實驗方法31-49
• 2.1 實驗材料31-35
• 2.1.1 實驗所用質(zhì)粒和菌株31
• 2.1.2 實驗動物31
• 2.1.3 實驗所用試劑31-32
• 2.1.4 實驗所用儀器32-34
• 2.1.5 實驗所用試劑的配制34-35
• 2.2 實驗方法35-49
• 2.2.1 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA蛋白的表達35
• 2.2.2 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA蛋白的純化35-36
• 2.2.3 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA的轉(zhuǎn)肽活性測定36-37
• 2.2.4 SaSrtA酶活水平的抑制劑篩選37
• 2.2.5 活性化合物的IC_(50)測定37-38
• 2.2.6 化合物的可逆性抑制的研究38
• 2.2.7 動力學(xué)測試實驗38-39
• 2.2.8 SDS-PAGE轉(zhuǎn)肽活性實驗39-40
• 2.2.9 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA的晶體培養(yǎng)、結(jié)構(gòu)解析及其與化合物SOMCL14283共結(jié)晶40
• 2.2.10 圓二色譜（CD）40-41
• 2.2.11 基于FITC-IGg檢測化合物對細胞壁上的SPA含量的影響41
• 2.2.12 熒光標記的熱遷移實驗（Fluorescence-Based Thermal Shift Assay）41-42
• 2.2.13 Western Blotting 檢測化合物對細胞壁上的 SPA 含量的影響42-43
• 2.2.14 高分辨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分析43-44
• 2.2.15 FASP酶解肽斷質(zhì)譜實驗44-45
• 2.2.16 化合物對細菌生長的影響45-46
• 2.2.17 化合物的動物急性毒性試驗46
• 2.2.18 金黃色葡萄球菌感染動物（小鼠）實驗46-49
• 第三章 實驗結(jié)果及討論49-71
• 3.1 SaSrtA蛋白的純化49-50
• 3.2 測定SaSrtA的米氏方程及Km值50
• 3.3 小分子抑制劑IC_(50)的測定50-53
• 3.4 基于SDS-PAGE對化合物抑制SaSrtA進行進一步驗證53-55
• 3.5 小分子抑制劑與SaSrtA的作用模式55-56
• 3.6 利用質(zhì)譜檢測化合物與SaSrtA的作用方式為不可逆的共價結(jié)合56-58
• 3.6.1 化合物完全抑制SaSrtA的活性所需要的比例56-57
• 3.6.2 質(zhì)譜分析57-58
• 3.7 FASP酶解肽斷二級質(zhì)譜確定化合物與SaSrtA的184位半胱氨酸不可逆共價結(jié)合58-59
• 3.8 化合物與SaSrtA共價結(jié)合的動力學(xué)曲線59-60
• 3.9 圓二色譜（CD）60-61
• 3.10 運用FITC-IGg的方法檢測金黃色葡萄球菌細胞壁上的SPA含量驗證化合物在活體水平上的抑制活性61-63
• 3.11 通過western blot的方法進一步驗證化合物在活體水平上的抑制活性63-65
• 3.12 化合物對細菌生長的影響65-67
• 3.12.1 化合物對Sa. Newman、Sa. 8325-4、Se. 1457、Bs. 681、Ec. DH5α的最小抑制細菌濃度（MIC）65-66
• 3.12.2 化合物SOMCL14283、SOMCL14284對金黃色葡萄球菌的生長曲線66-67
• 3.13 化合物的動物毒性實驗67-68
• 3.14 小鼠感染模型68
• 3.15 檢測化合物SOMCL14283與化合物SOMCL14284對其它革蘭氏陽性菌株的轉(zhuǎn)肽酶Sa SrtA的抑制作用68-71
• 第四章 實驗總結(jié)與討論71-75
• 4.1 實驗總結(jié)71-72
• 4.2 討論72-75
• 參考文獻75-85
• 附錄85-87
• 簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果87

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白潔;機組配餐員的金黃色葡萄球菌污染情況[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2002年02期

2 朱自強;;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年11期

3 杜洪利;張雙雙;歐旭;閆訓(xùn)友;;金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)研究進展[J];食品與發(fā)酵科技;2009年05期

4 黃嶺芳;賴衛(wèi)華;張莉莉;;食品中金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展[J];食品與機械;2009年06期

5 王娉;勞華均;胡s，

本文編號：593524