本文關(guān)鍵詞：新型廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的設(shè)計、合成和活性評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上最主要的抗菌藥物,它能夠作用于細菌細胞壁的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs),阻礙細胞壁的主要成分肽聚糖的合成,由于缺乏完整的細胞壁,在滲透壓的作用下,細菌不能維持正常的形態(tài),最終導(dǎo)致細胞破裂死亡,而達到殺菌的目的。但是,自從青霉素在臨床上運用以來,迫于生存壓力,細菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性,其中最主要的耐藥機制就是產(chǎn)生能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase enzymes)。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的種類增加,β-內(nèi)酰胺酶的種類也在不斷增多,并且在新的抗生素上市不久后就會出現(xiàn)能夠水解該類抗生素的酶。根據(jù)Ambler分類法,β-內(nèi)酰胺酶被分為A、B、C、D四類,其中,由于A、C、D類酶的活性位點都有活性絲氨酸殘基,又將它們稱為絲氨酸酶。而B類酶的活性位點含有一個或兩個金屬鋅離子,故也稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶。目前,擁有多種耐藥機制和能夠表達多種β-內(nèi)酰酶的多重耐藥菌(multiple resistance bacteria,MDR)是臨床上最具威脅性的致病菌。為了克服β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性問題,人們將β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組成復(fù)方制劑使用,極大地提高了β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺酶作用時,首先形成Michaelis復(fù)合物,然后酶活性位點處的絲氨酸殘基對β-內(nèi)酰環(huán)上的羰基進行親核進攻,使內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵斷裂,形成酶-底物共價化合物,使酶處于抑制狀態(tài)。目前,市場上的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑主要有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦,它們都含有與β-內(nèi)酰胺類抗生素相似的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)。但是,克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦只對A類絲氨酸酶有效,對B、C、D類酶基本沒有抑制效果,面對種類不斷增多的廣譜酶和多重耐藥菌,現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑根本無法滿足臨床的需求。阿維巴坦(Avibactam),屬于二氮雜二環(huán)辛烷類化合物。2015年2月,美國FDA批準(zhǔn)由阿特維斯(Actavis)與阿斯利康(AZN)聯(lián)合研發(fā)的新型復(fù)方制劑抗生素藥Avycaz(ceftazidime-avibactam,頭孢他啶-阿維巴坦)在美國上市,主要用于治療成人復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染(cIAI)及復(fù)雜性尿路感染(cUTI),同時也適用于治療方案有限或無替代治療方案的腎臟感染(腎盂腎炎)患者。與經(jīng)典的“自殺式酶抑制劑”相比,阿維巴坦與酶的作用機制有其獨特的優(yōu)越性:在絲氨酸酶的親核進攻下,阿維巴坦酰胺鍵斷裂,開環(huán)形成酶-抑制劑共價化合物,使酶處于抑制狀態(tài),且不發(fā)生水解,再經(jīng)環(huán)化恢復(fù)β-內(nèi)酰胺環(huán),重新得到具有抑酶活性的阿維巴坦。開環(huán)速率遠遠大于合環(huán)速率,使酶基本處于抑制狀態(tài)。由于阿維巴坦的結(jié)構(gòu)能恢復(fù),故具有長效性。阿維巴坦的出現(xiàn),打破了30多年來無新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可用的局面,由于阿維巴坦對a、c類酶和部分d類酶都具有抑制作用,對未來研發(fā)具有更廣譜的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開辟了新的道路,但是到目前為止仍然沒有對b類金屬β-內(nèi)酰胺酶和大部分d類酶起作用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。本文以阿維巴坦作為先導(dǎo)化合物,基于初步建立的構(gòu)效關(guān)系以及對酶-抑制劑晶體復(fù)合物的空間構(gòu)象和作用機制分析,設(shè)計了兩類具有二氮雜二環(huán)辛烷結(jié)構(gòu)并且保持陽性化合物原有構(gòu)型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,期望得到抑酶活性更好并且更具廣譜性的新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。本文對文獻報道的阿維巴坦合成工藝進行了改造和優(yōu)化。以(s)-1-(芐氧羰基)-5-氧代吡咯烷-2-羧酸為起始原料,經(jīng)過13步反應(yīng)得到阿維巴坦的鈉鹽。將文獻中的反應(yīng)從15步縮短為13步;文獻中所有反應(yīng)產(chǎn)物采用硅膠柱層析法分離純化,本文大部分采用重結(jié)晶方法替代;本文還對反應(yīng)過程中的參數(shù)進行優(yōu)化和確定,使反應(yīng)具備可控性和可重復(fù)性。阿維巴坦的光學(xué)純度和化學(xué)純度經(jīng)過hplc檢測,而na+含量還經(jīng)過agilenticp-ms測定,并且建立了有效的阿維巴坦化學(xué)純度和光學(xué)純度的檢測方法。改進后的工藝具有合成路線相對較短、操作簡單等優(yōu)點,并且收率比原文獻提高了兩倍,為進一步研發(fā)適合工業(yè)生產(chǎn)阿維巴坦的工藝路線奠定了重要基礎(chǔ)。參照阿維巴坦的合成工藝路線,本文合成了目標(biāo)化合物的關(guān)鍵中間體(2s,5r)-6-(芐氧基)-7-氧代-1,6-二氮雜環(huán)[3.2.1]辛烷-2-羧酸,在關(guān)鍵中間體的基礎(chǔ)上設(shè)計合成了兩類目標(biāo)化合物,總共合成19個新結(jié)構(gòu)目標(biāo)化合物,所有合成的中間體和目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)都經(jīng)過esi-ms和1h-nmr確認。目前,已經(jīng)對包括陽性化合物阿維巴坦在內(nèi)的20個化合物進行了初步的生物活性評價。首先對酶進行了滴定實驗,然后將待檢測目標(biāo)化合物配成12個濃度梯度,分別與classa類tem-1、classc類ampc和classd類oxa-23酶發(fā)生作用。以頭孢硝噻為底物,加入到酶與目標(biāo)化合物的混合物中,通過檢測混合物的吸光度,確定底物的含量,從而得出目標(biāo)化合物對酶的抑制率,以目標(biāo)化合物的ic50值來表示抑酶活性大小。通過生物活性評價結(jié)果顯示,r2基為芐氧基取代的第Ⅰ類目標(biāo)化合物ic50值普遍較高(10000nm);而保留先導(dǎo)化合物中的磺酸酯基,對r1進行改造得到的第Ⅱ類目標(biāo)化合物ic50值較低,具有較好的抑酶活性,特別是r1基為飽和脂肪鏈烴取代的目標(biāo)化合物。其中化合物l13、l14、l15和l19,同時對classa類酶tem-1和classc類酶ampc的ic50值都小于10nm,優(yōu)于陽性化合物阿維巴坦,具有進一步研究的價值。根據(jù)活性篩選結(jié)果,本文對所合成的新目標(biāo)化合物進行了初步的構(gòu)效關(guān)系分析:當(dāng)R1為4~5個C的飽和脂肪鏈烷烴,R2為磺酸酯基時,對A、C類酶的抑制活性較好;當(dāng)R2為芐氧基時,活性較差。以上分析結(jié)果對進一步研發(fā)新型廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制具有一定指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：β-內(nèi)酰胺酶 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑 阿維巴坦 化學(xué)合成 生物活性評價
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R91;R914.5
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 前言11-28
• 1.1 細菌耐藥性12-18
• 1.2 β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰類抗生素的作用機制18-21
• 1.3 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑21-23
• 1.4 具有臨床運用前景的 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑23-28
• 第二章 目標(biāo)化合物的設(shè)計28-31
• 2.1 阿維巴坦構(gòu)效關(guān)系分析29
• 2.2 目標(biāo)化合物的設(shè)計29-31
• 第三章 目標(biāo)化合物的合成31-51
• 3.1 阿維巴坦的合成工藝研究31-34
• 3.2 目標(biāo)化合物的合成34-39
• 3.3 實驗部分39-51
• 第四章 生物活性評價及結(jié)果分析51-57
• 4.1 實驗?zāi)康?/span>51
• 4.2 實驗材料和儀器51
• 4.3 實驗過程51-54
• 4.4 實驗結(jié)果54-56
• 4.5 實驗結(jié)論與構(gòu)效關(guān)系分析56-57
• 第五章 結(jié)語57-58
• 參考文獻58-64
• 附圖64-99
• 個人簡歷99-100
• 致謝100-101

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本文編號：501202