發(fā)布時(shí)間：2017-06-06 10:09

  本文關(guān)鍵詞：利用噬菌體展示淘選特異性結(jié)合sHB-EGF的活性多肽，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)能結(jié)合肝素,是表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員,與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合后,以旁分泌、自分泌、近分泌的形式發(fā)揮其生物活性。HB-EGF在很多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,例如傷口愈合、胚胎植入、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟發(fā)育等。臨床實(shí)驗(yàn)證明HB-EGF在乳腺癌和卵巢癌中過(guò)量表達(dá),特異性抑制HB-EGF及其下游信號(hào)通路后,腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)增加,生長(zhǎng)速度變慢,血管生成受到抑制,遷移侵潤(rùn)速率變慢;且拮抗HB-EGF和抗癌藥物聯(lián)合用藥時(shí),腫瘤的抗藥性大大降低,說(shuō)明HB-EGF與乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和抗藥性有密切的關(guān)系。所以,開(kāi)發(fā)特異性抑制HB-EGF的藥物可能會(huì)抑制相應(yīng)癌癥的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)在噬菌體外殼蛋白基因中插入序列隨機(jī)的外源多肽編碼序列,多肽以融合蛋白的形式被展示在病毒的表面,這樣就使得病毒內(nèi)編碼外源多肽的基因序列與病毒表面的多肽建立了直接聯(lián)系。體外噬菌體展示的流程是先將肽庫(kù)與固定的靶分子結(jié)合,洗去未結(jié)合的噬菌體,繼而將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)并通過(guò)轉(zhuǎn)染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增。三到五輪淘選之后,即可富集到與靶分子具有高親和力的噬菌體。多肽的DNA序列可以通過(guò)測(cè)序得知。多肽藥物具有免疫原性低、分子量小和易吸收等優(yōu)點(diǎn),所以本課題旨在通過(guò)噬菌體展示技術(shù)淘選到能特異性結(jié)合HB-EGF并能抑制其活性的多肽,從而為研發(fā)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。本課題首先利用PCR獲得sHB-EGF基因,經(jīng)雙酶切將目的基因?qū)朐吮磉_(dá)載體pET-30a后,重組載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌BL21(DE3),細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)出sHB-EGF。經(jīng)鎳柱親和層析和肝素親和層析純化后我們得到大量純蛋白(His)6-sHB-EGF。為避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,我們用腸激酶去掉占全長(zhǎng)重組蛋白53%的(His)6標(biāo)簽,得到sHB-EGF蛋白。我們以sHB-EGF為靶分子,按照結(jié)合-清洗-洗脫的流程進(jìn)行了兩次體外噬菌體展示:分別用肝素鈉和sHB-EGF配制洗脫液進(jìn)行淘選,并最終獲得了三個(gè)候選多肽——TUZG1、2和3。后經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)證明:TUZG1、2和3都與sHB-EGF特異性結(jié)合。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí),sHB-EGF具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3遷移和侵潤(rùn)的作用。通過(guò)多肽生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn):候選多肽TUZG3能顯著抑制sHB-EGF的促遷移和促侵潤(rùn)作用,而TUZG1和TUZG2對(duì)sHB-EGF的促遷移和促侵潤(rùn)作用沒(méi)有顯著影響。由于TUZG1和TUZG2是肝素鈉洗脫下來(lái)的多肽,我們因此推測(cè)其可能具有與肝素類(lèi)似的抗凝血作用。經(jīng)APTT、試管法、剪尾法驗(yàn)證TUZG2確實(shí)具有與肝素類(lèi)似的抗凝血活性。綜上所述,我們通過(guò)分子克隆、原核表達(dá)、親和層析等方法,獲得了高純度靶分子sHB-EGF;利用噬菌體展示獲得了特異性結(jié)合sHB-EGF的三條候選多肽;最后經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),TUZG3能抑制sHB-EGF的促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的作用,為后續(xù)藥物研發(fā)打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：HB-EGF 噬菌體展示 多肽 遷移侵潤(rùn) 抗凝血
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 緒論13-25
• 1.1 HB-EGF簡(jiǎn)介13-20
• 1.1.1 HB-EGF的基因結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.2 HB-EGF的加工和信號(hào)通路14
• 1.1.3 HB-EGF與乳腺癌14-16
• 1.1.4 HB-EGF與卵巢癌16-18
• 1.1.5 HB-EGF在其他腫瘤中的作用18-19
• 1.1.6 利用HB-EGF抗癌的探索19-20
• 1.2 噬菌體展示技術(shù)在生物制藥上的應(yīng)用20-24
• 1.2.1 篩選特異性結(jié)合配體或蛋白的生物活性肽21
• 1.2.2 蛋白-蛋白互作21-22
• 1.2.3 篩選細(xì)胞特異性結(jié)合多肽22-23
• 1.2.4 淘選器官特異性結(jié)合多肽23-24
• 1.3 本課題的研究?jī)?nèi)容和意義24-25
• 第二章 sHB-EGF的原核表達(dá)25-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑25-27
• 2.1.1 儀器25-26
• 2.1.2 材料與試劑26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-35
• 2.2.1 試劑配制27-30
• 2.2.2 目的基因sHB-EGF的獲取30-31
• 2.2.3 表達(dá)載體pET-30a-His-HB-EGF的構(gòu)建31-33
• 2.2.4 驗(yàn)證sHB-EGF插入載體33
• 2.2.5 誘導(dǎo)目的蛋白(His)6-sHB-EGF的表達(dá)33-34
• 2.2.6 驗(yàn)證(His)6-sHB-EGF的表達(dá)34-35
• 2.3 結(jié)果與分析35-37
• 2.3.1 pET-30a-His-sHB-EGF表達(dá)載體的構(gòu)建35-36
• 2.3.2 驗(yàn)證(His)6-sHB-EGF的表達(dá)36-37
• 2.4 討論與小結(jié)37-39
• 第三章 sHB-EGF的純化39-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑39
• 3.1.1 儀器39
• 3.1.2 材料與試劑39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 3.2.1 緩沖液的配制39-40
• 3.2.2 鎳柱親和層析40
• 3.2.3 肝素親和層析40-41
• 3.2.4 腸激酶切去重組蛋白(His)6標(biāo)簽41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.3.1 蛋白純化和酶切去(His)6標(biāo)簽41-42
• 3.4 討論與小結(jié)42-44
• 第四章 sHB-EGF對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的作用44-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑44-46
• 4.1.1 儀器44
• 4.1.2 材料與試劑44-46
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 4.2.1 試劑配制46
• 4.2.2 MTT檢測(cè)sHB-EGF對(duì)細(xì)胞增殖率的影響46-47
• 4.2.3 sHB-EGF過(guò)表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞遷移侵潤(rùn)的影響47-49
• 4.2.4 sHB-EGF敲減對(duì)癌細(xì)胞遷移侵潤(rùn)的影響49-51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-55
• 4.3.1 sHB-EGF對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響51
• 4.3.2 sHB-EGF對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的影響51-55
• 4.4 討論與小結(jié)55-56
• 第五章 噬菌體展示預(yù)實(shí)驗(yàn)56-65
• 5.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑56-57
• 5.1.1 儀器56
• 5.1.2 材料與試劑56-57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法57-63
• 5.2.1 試劑配制57-60
• 5.2.2 噬菌體滴度測(cè)定60
• 5.2.3 淘選流程60-62
• 5.2.4 單克隆噬菌體擴(kuò)增62
• 5.2.5 測(cè)序62-63
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-64
• 5.3.1 隨機(jī)序列分析63-64
• 5.4 討論與小結(jié)64-65
• 第六章 淘選特異性結(jié)合sHB-EGF的多肽65-70
• 6.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑65
• 6.1.1 儀器65
• 6.1.2 材料與試劑65
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法65-67
• 6.2.1 試劑配制65
• 6.2.2 噬菌體滴度測(cè)定65-66
• 6.2.3 淘選流程66
• 6.2.4 單克隆噬菌體擴(kuò)增66
• 6.2.5 測(cè)序66
• 6.2.6 ELISA檢測(cè)多肽與靶分子的親和力66-67
• 6.3 結(jié)果與分析67-69
• 6.3.1 隨機(jī)多肽序列分析67-68
• 6.3.2 候選多肽TUZG1、TUZG2和TUZG3與靶分子的親和力驗(yàn)證68-69
• 6.4 討論與小結(jié)69-70
• 第七章 候選多肽的生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證70-76
• 7.1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑70
• 7.1.1 儀器70
• 7.1.2 材料與試劑70
• 7.2 實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 7.2.1 試劑配制70
• 7.2.2 隨機(jī)肽Random 12的非特異性驗(yàn)證70
• 7.2.3 候選多肽TUZG1和TUZG2對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的影響70-71
• 7.2.4 候選多肽TUZG3的抑癌效應(yīng)驗(yàn)證71
• 7.2.5 TUZG1和TUZG2抗凝血作用檢測(cè)71-72
• 7.3 結(jié)果與分析72-75
• 7.3.1 TUZG1和TUZG2對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的影響72
• 7.3.2 多肽TUZG3對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的影響72-73
• 7.3.3 TUZG1和TUZG2抗凝血作用檢測(cè)73-75
• 7.4 討論與小結(jié)75-76
• 第八章 總結(jié)與展望76-78
• 8.1 工作總結(jié)76
• 8.2 工作展望76-78
• 參考文獻(xiàn)78-87
• 致謝87-88
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果88

【相似文獻(xiàn)】

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1 蔣芝君,錢(qián)e

本文編號(hào)：426042