背景:低堿性磷酸酯酶癥(Hypophospatasia,HPP)是由于非組織特異性堿性磷酸酶(tissue nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)活性降低造成的罕見病。TNSALP在人體中有重要的作用,缺少時會造成人體的骨骼礦化不良,從而出現(xiàn)骨折等癥狀。2015年FDA批準重組堿性磷酸酶抗體藥物(rTNSALP-FcD10)可用于治療HPP,但目前rTNSALP-FcD10抗體藥物還沒有在國內(nèi)上市。rTNSALP-FcD10具有延長半衰期并有利成骨細胞靶向性的特性,但其產(chǎn)量較低、成本高,對HPP病患者的需求及家庭產(chǎn)生較大負擔(dān)。目的:本項目針對如上問題,查閱文獻,本實驗擬構(gòu)建重組TNSALP的真核表達載體,試圖篩選出更高效的重組表達質(zhì)粒,獲得能夠穩(wěn)定表達rTNSALP-FcD10蛋白且表達量相對較高的中國倉鼠卵巢細胞株,為今后在中國規(guī)�；a(chǎn)rTNSALP-FcD10蛋白建立基礎(chǔ)。方法:(1)去掉TNSALP分子N-末端的信號肽序列及C-末端的GPI錨定信號,并與人抗體的Fc片段和10個天冬氨酸重組成融合蛋白rTNSALP-FcD10,將rTNS...

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【學(xué)位級別】：碩士

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圖1真核表達載體pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10重組構(gòu)建流程

驗結(jié)果核表達載體的構(gòu)建及鑒定了在真核細胞CHO-K1中異源表達rTNSALP-FcD10蛋白，LP-FcD10基因序列分別克隆至pcDNA3.1及pEF1/Myc-HisB表達達載體只有啟動子不同，應(yīng)用兩個表達載體是為了能夠篩選出更高載體，為后續(xù)蛋白的純化以及....

圖2真核表達載體pEF1-rTNSALP-FcD10重組構(gòu)建流程

圖2真核表達載體pEF1-rTNSALP-FcD10重組構(gòu)建流程Fig.2ConstructionofpEF1-rTNSALP-FcD10recombinantexpressionvector重組表達載體的構(gòu)建及鑒定們利用酶切的方法對重組表達載體pcDNA....

圖3pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10質(zhì)粒（A）和pEF1-rTNSALP-FcD10質(zhì)粒（B）雙酶切驗證

：DNAmarker；1：pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10質(zhì)粒；2：pEF1-rTNSALP-FcD10質(zhì)pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10質(zhì)粒（A）和pEF1-rTNSALP-FcD10質(zhì)粒（B）雙酶切ig.3Recombinantpla....

圖4RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞rTNSALP-FcD10基因在mRNA水平的表達Fig.4RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofrTNSALP-FcD10geneatmRNAlevel

27圖4RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞rTNSALP-FcD10基因在mRNA水平的表達Fig.4RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofrTNSALP-FcD10geneatmRNAlevel注：圖A表....

本文編號：3921757