不良的藥代動力學特征,藥物的毒副作用,特別是藥物耐藥性的出現(xiàn),使化療藥物在臨床腫瘤治療中的效果大幅降低。而海洋復雜多變的生存環(huán)境,賦予了生活在其中的生物特殊的抵御手段,這些化學或者生物適應產(chǎn)生了許多具有特殊生物活性和潛在抗腫瘤效應的化合物。Thiocoraline即噻可拉林,為含硫縮肽,是一種DNA雙嵌插劑,最初是從海洋單胞菌Micromonospora marina中分離得到,在抗癌活性方面有很好的效果。本課題以thiocoraline為研究對象,研究thiocoraline抗腫瘤活性及乳腺癌對thiocoraline產(chǎn)生耐藥的分子機制。使用MTT法檢測thiocoraline對MCF-7細胞,L-02細胞的毒性作用;利用MTT法和結(jié)晶紫染色比較thiocoraline和doxorubicin對MCF-7細胞的作用效果;流式細胞術(shù)檢測thiocoraline對細胞周期的影響;Hoechst 33342和Western Blot檢測thiocoraline誘導細胞凋亡情況;通過濃度梯度遞增法培養(yǎng)得到對thiocoraline耐藥的MCF-7/T細胞株,并確定其耐藥指數(shù)。利用生長曲線和克...

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 腫瘤
    1.2 DNA嵌插劑與腫瘤治療
    1.3 Thiocoraline的研究進展
    1.4 腫瘤多藥耐藥及其發(fā)生機制
        1.4.1 膜蛋白外排泵介導細胞耐藥
        1.4.2 細胞內(nèi)相關(guān)酶介導耐藥
        1.4.3 信號通路異常介導的耐藥
        1.4.4 細胞凋亡介導耐藥
    1.5 本課題研究內(nèi)容及意義
第二章 Thiocoraline的抗腫瘤活性研究
    2.1 材料
        2.1.1 實驗藥物
        2.1.2 細胞株
    2.2 主要試劑與儀器
        2.2.1 試劑
        2.2.2 儀器
    2.3 主要溶液的配制
        2.3.1 PBS磷酸鹽緩沖液(1×)
        2.3.2 5mg/mLMTT溶液
        2.3.3 2%結(jié)晶紫溶液
        2.3.4 PBST(1×)
        2.3.5 10%(w/v)過硫酸銨(APS)溶液
        2.3.6 10%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液
        2.3.7 Tris-甘氨酸電泳緩沖液(1×)
        2.3.8 Tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)緩沖液(1×)
        2.3.9 細胞培養(yǎng)基
        2.3.10 Thiocoraline母液配制
        2.3.11 Doxorubicin母液配制
    2.4 實驗方法
        2.4.1 細胞培養(yǎng)
        2.4.2 MTT法檢測thiocoraline對MCF-7細胞,L-02細胞的毒性作用
        2.4.3 結(jié)晶紫染色比較thiocoraline和doxorubicin對MCF-7細胞的作用效果
        2.4.4 流式細胞術(shù)檢測thiocoraline對細胞周期的影響
        2.4.5 Hoechst33342檢測細胞凋亡
        2.4.6 WesternBlot分析thiocoraline誘導細胞凋亡的作用機制
        2.4.7 統(tǒng)計學分析
    2.5 實驗結(jié)果
        2.5.1 MTT法檢測thiocoraline對MCF-7細胞的毒性作用
        2.5.2 Thiocoraline作用于MCF-7細胞的半抑制有效濃度的測定
        2.5.3 Thiocoraline安全性效果評價
        2.5.4 MTT法檢測doxorubicin對MCF-7細胞的毒性作用
        2.5.5 Doxorubicin作用于MCF-7細胞的半抑制有效濃度的測定
        2.5.6 結(jié)晶紫染色法比較thiocoraline,doxorubicin對MCF-7細胞的毒性作用
        2.5.7 細胞周期檢測
        2.5.8 Hoechst33342檢測細胞凋亡
        2.5.9 Thiocoraline通過Caspase通路誘導MCF-7細胞凋亡
    2.6 總結(jié)與討論
第三章 MCF-7細胞對thiocoraline耐藥機制的研究
    3.1 材料
        3.1.1 實驗藥物
        3.1.2 細胞株
    3.2 主要試劑與儀器
        3.2.1 試劑
        3.2.2 儀器
    3.3 主要溶液的配制
        3.3.1 LB液體培養(yǎng)基
        3.3.2 TAE(50×)
        3.3.3 MK-2206HCl母液配制
    3.4 實驗方法
        3.4.1 細胞培養(yǎng)
        3.4.2 Thiocoraline耐藥株MCF-7/T的構(gòu)建
        3.4.3 MCF-7/Akt1高表達株的構(gòu)建
        3.4.4 細胞生長曲線測定
        3.4.5 克隆形成能力檢測
        3.4.6 MTT法測定細胞活性
        3.4.7 Trizol法提取總RNA
        3.4.8 半定量RT-PCR檢測乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白的表達水平
        3.4.9 qPCR檢測乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白的表達水平
        3.4.10 WesternBlot檢測蛋白表達水平
        3.4.11 統(tǒng)計學分析
    3.5 實驗結(jié)果
        3.5.1 MCF-7/T的耐藥指數(shù)
        3.5.2 MCF-7/T與MCF-7細胞生物學特征比較
        3.5.3 半定量RT-PCR初步檢測乳腺癌相關(guān)耐藥蛋白的表達水平
        3.5.4 qPCR及WesternBlot檢測MCF-7/T耐藥細胞內(nèi)蛋白水平變化
        3.5.5 Thiocoraline作用MCF-7細胞72h后相關(guān)蛋白水平的分析
        3.5.6 MCF-7細胞內(nèi)Akt的磷酸化水平提高及其對thiocoraline敏感性的分析
        3.5.7 抑制MCF-7細胞內(nèi)Akt磷酸化水平及其對thiocoraline敏感性分析
        3.5.8 抑制耐藥株MCF-7/T細胞內(nèi)Akt磷酸化水平及其對thiocoraline敏感性分析
    3.6 總結(jié)與討論
結(jié)論
參考文獻
碩士期間已發(fā)表論文
致謝



本文編號：3902758