目的本研究旨在應用體外培養(yǎng)的人源心肌細胞揭示曲格列酮誘導的心肌細胞毒性特征,并從線粒體氧化應激和自噬角度探討其潛在的毒作用機制。方法應用人源心肌細胞AC16,給予不同濃度的曲格列酮處理24 h,通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變;CCK-8法檢測細胞存活率;LDH檢測膜完整性評價藥物的細胞毒性。應用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng),利用熒光探針TMRM和CM-H₂DCFDA檢測線粒體膜電位和全細胞活性氧自由基的水平;利用熒光素酶化學發(fā)光法檢測ATP含量變化;應用RT-qPCR檢測mtDNA變化評價藥物線粒體毒性。Western blotting檢測調(diào)控線粒體新生的PGC-1α信號通路和調(diào)節(jié)細胞抗氧化的Nrf2信號通路;自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值和p62蛋白的表達。結(jié)果與正常對照組相比,曲格列酮可劑量依賴性引起細胞質(zhì)皺縮、細胞存活率顯著下降(r=-0.928,P<0.05)和LDH漏出增加(r=0.746,P<0.05);給予10、20μM的曲格列酮可明顯降低細胞線粒體膜電位、mtDNA拷貝數(shù)、ATP含量,增加活性氧自由基含量(P<0.05);曲格列酮可顯著...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中英文縮略詞對照表
摘要
Abstract
前言
第一部分 曲格列酮對AC16細胞毒性作用的影響
    1.1 前言
    1.2 實驗材料
        1.2.1 實驗細胞
        1.2.2 細胞培養(yǎng)主要試劑
        1.2.3 細胞培養(yǎng)主要耗材
        1.2.4 細胞培養(yǎng)主要儀器
        1.2.5 溶液配制
    1.3 實驗方法
        1.3.1 AC16 細胞的培養(yǎng)
        1.3.2 形態(tài)觀察
        1.3.3 CCK-8 法測細胞存活率
        1.3.4 LDH法測細胞膜完整性
        1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析
    1.4 實驗結(jié)果
        1.4.1 曲格列酮對AC16 細胞形態(tài)的影響
        1.4.2 曲格列酮對AC16 細胞存活率的影響
        1.4.3 曲格列酮對AC16 細胞LDH漏出的影響
    1.5 討論
    1.6 小結(jié)
第二部分 曲格列酮對AC16 細胞線粒體功能的影響
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗細胞
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要耗材
        2.2.4 主要儀器
        2.2.5 溶液配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 AC16 細胞的培養(yǎng)
        2.3.2 Mito SOX Red測線粒體ROS
        2.3.3 CM-H2DCFDA測全細胞ROS
        2.3.4 Mito tracker Green測線粒體含量
        2.3.5 TMRM測線粒體膜電位
        2.3.6 RT-qPCR測 mtDNA
        2.3.7 熒光素酶測ATP含量
        2.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 曲格列酮對AC16 細胞ROS的影響
        2.4.2 曲格列酮對AC16 細胞線粒體含量和膜電位的影響
        2.4.3 曲格列酮對AC16 細胞mtDNA的影響
        2.4.4 曲格列酮對AC16 細胞ATP含量的影響
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三部分 曲格列酮對AC16 細胞PGC-1α和 Nrf2 通路的影響
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗細胞
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要耗材
        3.2.4 主要儀器
        3.2.5 Western blotting主要試劑配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 AC16 細胞的培養(yǎng)
        3.3.2 蛋白免疫印跡
        3.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 曲格列酮對AC16 細胞PGC-1α通路的影響
        3.4.2 曲格列酮對AC16 細胞Nrf2 通路的影響
        3.4.3 曲格列酮對AC16 細胞PGC-1α和 Nrf2 通路的時間效應
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四部分 曲格列酮對AC16 細胞自噬的影響
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗細胞
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 主要耗材
        4.2.4 主要儀器
        4.2.5 溶液配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 AC16 細胞的培養(yǎng)
        4.3.2 蛋白免疫印跡
        4.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 曲格列酮對AC16 細胞自噬蛋白的影響
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
討論
致謝
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文
導師評閱表



本文編號：3885786