發(fā)布時(shí)間：2017-05-18 13:15

  本文關(guān)鍵詞：載鹽霉素的聚乙二醇—神經(jīng)酰胺膠束的抗肝癌作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本課題成功設(shè)計(jì)了載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM),它將具有治療作用的鹽霉素(SAL)包載于載體聚乙二醇-神經(jīng)酰胺(PEG-CRM)形成的膠束內(nèi),以同時(shí)殺傷肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞。由于可提高SAL的水溶性和載體對(duì)普通肝癌細(xì)胞的殺傷能力的增強(qiáng)作用,加之膠束的滲透性使得更多的SAL靶向到腫瘤部位,為肝癌的治療提供新的策略。首先,利用高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法建立鹽霉素的體內(nèi)外檢測(cè)方法學(xué),并考察方法學(xué)的專屬性、線性、精密度和準(zhǔn)確度等,為SAL的體內(nèi)外測(cè)定提供基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,該方法測(cè)定SAL具有特異性,且在7.8~1000μg/mL的濃度范圍內(nèi),SAL的濃度(C)與峰面積(A)呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為A=1012.4C+7115.6(R2=0.9999)。本課題所建立的高效液相色譜法所測(cè)得的SAL的精密度和準(zhǔn)確度變動(dòng)范圍均在3%之內(nèi),表明該方法學(xué)可用于測(cè)定SAL的濃度,符合實(shí)驗(yàn)的要求。以非諾貝特(FNBT)為內(nèi)標(biāo)建立測(cè)定體內(nèi)SAL的LC-MS檢測(cè)方法,線性范圍為20~1000ng/m L時(shí),線性回歸方程為A=0.005995C-0.01851,R2=0.999,定量下限為20ng/mL。當(dāng)S/N≥3時(shí),SAL的最低檢測(cè)限為4 ng/mL,可滿足實(shí)驗(yàn)的要求。其次,主要考察鹽霉素和聚乙二醇-神經(jīng)酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的殺傷毒性。我們選取的是肝癌HepG2細(xì)胞系以及通過(guò)懸浮狀態(tài)培養(yǎng)形成的HepG2微球體。大量培養(yǎng)HepG2細(xì)胞并考察SAL和PEG-ceramide兩種藥物在HepG2細(xì)胞系的相互作用,即將兩種游離藥物分別以1:2,1:3,1:4三種摩爾比例混合,對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷,篩選得到游離SAL和PEG-ceramide兩者聯(lián)用比例為1:4或1:2(mol/mol)時(shí),對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷效果較好。隨后制備兩種藥載比的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束,對(duì)HepG2細(xì)胞及其微球體進(jìn)行殺傷,發(fā)現(xiàn)兩種藥載比膠束的殺傷效果無(wú)顯著性差異,但是考慮到鹽霉素的毒性,最終確定1:4為SAL和PEG-ceramide兩藥聯(lián)合作用的最佳協(xié)同比例。第三,利用薄膜分散法制備上述優(yōu)化比例的載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束,并對(duì)其理化性質(zhì),包括粒徑、Zeta電位、臨界膠束濃度(CMC)、包封率、載藥量及體外釋放度進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)所制備的載藥膠束粒徑為11.02±2.34nm,Zeta電位為-5.66±0.77mV,臨界膠束濃度值為7.94μg/mL,包封率和載藥量分別為76.74±4.05%和6.32±0.57%,在中性條件下48h累計(jì)釋放率為65%,表現(xiàn)出一定的緩釋特性。用透射電鏡觀察其形態(tài),發(fā)現(xiàn)其大小均一,分散均勻且無(wú)粘連。第四,我們將上述制備的優(yōu)化比例的載藥膠束(SCM)進(jìn)行了體外細(xì)胞學(xué)考察,包括采用CCK-8(Cell Counting Kit-8,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒)法測(cè)定膠束對(duì)HepG2細(xì)胞及其微球體的毒性,Annexin V-FITC/PI雙染法考察肝癌Hep G2細(xì)胞和微球體的凋亡,克隆形成實(shí)驗(yàn)、微球體形成率實(shí)驗(yàn)測(cè)定HepG2細(xì)胞及其微球體給藥后各組肝癌細(xì)胞的增殖能力以及利用激光共聚焦儀器考察肝癌HepG2細(xì)胞、HepG2-TS及HepG2-TS單細(xì)胞懸液對(duì)載熒光物質(zhì)的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束的攝取能力。結(jié)果表明,將SAL以1:4的藥載比包裹于PEG-ceramide膠束中較游離SAL對(duì)HepG2細(xì)胞以及微球體的細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng),而且,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,HepG2細(xì)胞及HepG2-TS對(duì)載熒光物質(zhì)PECF的PEG-ceramide膠束的攝取能力更強(qiáng),進(jìn)一步表明聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束具有較強(qiáng)的靶向肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的能力。最后,我們對(duì)新制備的載藥膠束進(jìn)行了體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的考察。首先考察膠束載體對(duì)BALB/C小鼠的安全性,即小鼠尾靜脈給藥后,對(duì)小鼠心、肝、脾、肺、腎做CD68免疫組化和HE染色,并對(duì)小鼠血液進(jìn)行血常規(guī)分析,結(jié)果表明膠束載體僅對(duì)小鼠肝和腎產(chǎn)生輕微的毒性,且具有一過(guò)性,具備用藥安全特性。其次,制備包載熒光探針Dir的PEG-ceramide膠束,通過(guò)建立HepG2荷瘤裸鼠模型,評(píng)價(jià)熒光膠束在動(dòng)物體內(nèi)的分布和腫瘤靶向性,結(jié)果表明載Dir熒光物質(zhì)的膠束主要分布在肝和腫瘤中,且在腫瘤部位有更多的蓄積,具有很強(qiáng)的腫瘤靶向和腫瘤滲透性。隨后制備腫瘤冰凍切片以期探討載PECF熒光染料膠束的靶向性,結(jié)果顯示載PECF的熒光膠束在腫瘤部位的熒光強(qiáng)度最大,靶向性最好。接著利用LC-MS分析載藥膠束在SD大鼠體內(nèi)有關(guān)鹽霉素的藥動(dòng)學(xué)特征,結(jié)果顯示載藥聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM)和載藥DSPE-PEG膠束(SDM)均可延緩SAL在血漿中的消除,而且SCM效果更顯著。最后從離體腫瘤的大小、離體腫瘤的重量、腫瘤體積生長(zhǎng)曲線以及裸鼠體重變化四個(gè)方面考察各組藥物處方的體內(nèi)抗腫瘤活性與系統(tǒng)毒性,結(jié)果顯示SCM膠束組無(wú)明顯的系統(tǒng)毒性,且抗腫瘤活性效果更佳。綜上所述,本課題所制備的載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束能夠有效的殺傷肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞,具有較好的體內(nèi)的抗腫瘤活性,在肝癌治療方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束 鹽霉素 肝癌細(xì)胞 肝癌干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-16
• 第一章 SAL體外含量測(cè)定方法的建立16-21
• 一、儀器與試劑16-17
• （一）儀器16
• （二）材料與試劑16-17
• 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果17-20
• （一）SAL含量測(cè)定方法的建立17-18
• （二）SAL含量測(cè)定方法的結(jié)果18-20
• 三、小結(jié)20-21
• 第二章 SAL和PEG-ceramide的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)21-29
• 一、儀器與試劑21-22
• （一）儀器21
• （二）試劑21-22
• （三）細(xì)胞22
• 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果22-28
• （一）肝癌Hep G2細(xì)胞及HepG2微球體的培養(yǎng)22-24
• （二）細(xì)胞毒性及結(jié)果24-26
• （三）協(xié)同比例的確定及結(jié)果26-28
• 三、小結(jié)28-29
• 第三章 納米膠束的制備及表征29-35
• 一、儀器與試劑29-30
• （一）儀器29
• （二）試劑29-30
• 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果30-34
• （一）納米膠束的制備30
• （二）納米膠束的處方優(yōu)化30-31
• （三）納米膠束的表征31-34
• 三、小結(jié)34-35
• 第四章 體外抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的活性研究35-47
• 一、儀器與材料35-36
• （一）儀器35
• （二）材料35-36
• （三）細(xì)胞36
• 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果36-46
• （一）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)36-39
• （二）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)39-42
• （三）克隆形成實(shí)驗(yàn)42-44
• （四）微球體形成率實(shí)驗(yàn)44
• （五）細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)44-46
• 三、小結(jié)46-47
• 第五章 納米膠束的體內(nèi)抗肝癌活性研究47-63
• 一、儀器與試劑47-48
• （一）儀器47
• （二）材料47-48
• （三）動(dòng)物48
• 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果48-61
• （一）膠束體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)48-51
• （二）膠束體內(nèi)靶向性評(píng)價(jià)51-54
• （四）膠束體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)54-58
• （五）膠束體內(nèi)藥效學(xué)研究58-61
• 三、小結(jié)61-63
• 全文總結(jié)63-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 腫瘤治療新策略：聯(lián)合藥物療法同時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞（綜述）71-83
• 參考文獻(xiàn)77-83
• 碩士期間發(fā)表論文及參加科研工作情況83-84
• 致謝84

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