結核病（TB）是由結核桿菌感染引起的慢性傳染性疾病,結核病對全球健康構成持久威脅,目前全球近1/3人口患有潛伏性結核病,每年有近180萬人因結核病死亡。近40年內(nèi),除了貝達喹啉和德拉瑪尼外沒有新藥的出現(xiàn),因此迫切需要具有新作用機理的藥物。擁有獨特殺菌機理且使微生物不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌肽有望成為抗分枝桿菌感染的潛在藥物。對實驗室現(xiàn)有的抗菌肽進行篩選,發(fā)現(xiàn)D型、L型和D/L型三種構型抗菌肽W3R6對恥垢分枝桿菌（ATCC 700084）（Mycobacterium smegmatis,M.s）的最小抑菌濃度分別為6.25μM、12.5μM和6.25μM,對抗菌肽進行改造,在D型W3R6的N端鏈接了疏水脂肪鏈基團乙�；�、丁酸�；�、正辛酸�；⒃鹿鹚狨；妥貦八狨；�,以期通過疏水性的調(diào)整增強抗菌活性,結果發(fā)現(xiàn),AC-D-W3R6和BA-D-W3R6的MIC值均降為3.13μM,但是隨著疏水性的增加,抗菌肽OA-D-W3R6、LA-D-W3R6和PA-D-W3R6的細胞毒性也逐漸增強,因此本論文選擇了活性較好且細胞毒性較弱的抗菌肽W3R6及其改造肽,以分枝桿菌的實驗室模式菌恥垢分枝桿菌為研究對象... 

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 綜述
    1.1 結核病簡介
        1.1.1 結核病的現(xiàn)狀
        1.1.2 結核病治療的發(fā)展史
        1.1.3 一線抗結核藥物的作用機制
    1.2 分枝桿菌簡介
        1.2.1 分枝桿菌的生長特性
        1.2.2 結核分枝桿菌的致病過程
        1.2.3 結核分枝桿菌的細胞壁
    1.3 抗菌肽與分枝桿菌相互作用
        1.3.1 抗菌肽的天然分類和理化性質(zhì)
        1.3.2 抗菌肽的結構與活性關系
        1.3.3 抗菌肽的作用機制
2 抗菌肽的篩選及改造
    2.1 實驗材料和儀器
        2.1.1 多肽的合成
        2.1.2 主要材料和試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 恥垢分枝桿菌的復蘇、傳代和菌種保存
        2.2.2 抗菌肽對于恥垢分枝桿菌的最小抑菌濃度實驗
        2.2.3 W3R6系列抗菌肽的改造
        2.2.4 改造后的W3R6系列抗菌肽對恥垢分枝桿菌的最小抑菌濃度實驗
        2.2.5 抗菌肽W3R6及其改造肽溶血活性的檢測
        2.2.6 抗菌肽W3R6及其改造肽對于THP-1細胞活力的影響
    2.3 實驗結果
        2.3.1 抗菌肽對于恥垢分枝桿菌的抗菌活性
        2.3.2 W3R6系列抗菌肽的改造合成
        2.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽的抗分枝桿菌活性
        2.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽的細胞毒性
    2.4 討論
3 抗菌肽W3R6及其改造肽的抗分枝桿菌活性及穩(wěn)定性
    3.1 實驗材料和儀器
        3.1.1 多肽的合成
        3.1.2 主要材料和試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 抗菌肽W3R6 及其改造肽對H37Ra和 BCG的最小抑菌濃度實驗
        3.2.2 抗菌肽W3R6及其改造肽殺菌動力學實驗
        3.2.3 抗菌肽W3R6及其改造肽對于胞內(nèi)生長的恥垢分枝桿菌的殺菌活性檢測
        3.2.4 棋盤微量稀釋法檢測抗菌肽W3R6及其改造肽與抗生素的聯(lián)合作用
        3.2.5 發(fā)展耐藥性實驗
        3.2.6 圓二色譜法檢測抗菌肽W3R6及其改造肽的二級結構
        3.2.7 RT-HPLC法檢測抗菌肽W3R6 及其改造肽在人血清環(huán)境中的穩(wěn)定性
    3.3 實驗結果
        3.3.1 抗菌肽W3R6 及其改造肽對H37Ra和 BCG的抗菌活性
        3.3.2 抗菌肽W3R6及其改造肽殺菌動力學
        3.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽對于胞內(nèi)生長的恥垢分枝桿菌的殺菌活性
        3.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽與抗生素的聯(lián)合作用
        3.3.5 發(fā)展耐藥性實驗
        3.3.6 抗菌肽W3R6及其改造肽的二級結構
        3.3.7 抗菌肽W3R6及其改造肽在人血清環(huán)境中的穩(wěn)定性
    3.4 討論
4 抗菌肽W3R6及其改造肽的膜作用機制
    4.1 實驗材料和儀器
        4.1.1 多肽的合成
        4.1.2 主要材料和試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 LIVE/DEAD試劑盒法檢測抗菌肽W3R6 及其改造肽對恥垢分枝桿菌細胞膜的影響
        4.2.2 掃描電鏡實驗觀察抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌細胞膜的影響
        4.2.3 Zeta電位檢測抗菌肽W3R6 及其改造肽與恥垢分枝桿菌的結合情況
        4.2.4 NPN實驗檢測抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌外膜通透性的影響
        4.2.5 去極化實驗檢測抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌內(nèi)膜通透性的影響
        4.2.6 鈣黃綠素釋放實驗檢測抗菌肽W3R6及其改造肽對分枝桿菌內(nèi)膜模擬膜的影響
    4.3 實驗結果
        4.3.1 激光掃描共焦顯微鏡觀察抗菌肽對恥垢分枝桿菌細胞膜的影響
        4.3.2 掃描電鏡下觀察抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌形態(tài)的影響
        4.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌結合情況
        4.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌外膜通透性的影響
        4.3.5 抗菌肽W3R6及其改造肽對恥垢分枝桿菌內(nèi)膜的影響
    4.4 討論
5 抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌基因組DNA的相互作用
    5.1 實驗材料和儀器
        5.1.1 多肽的合成
        5.1.2 主要材料和試劑
        5.1.3 主要儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 CLSM觀察抗菌肽D-W3R6 與恥垢分枝桿菌的共定位情況
        5.2.2 CTAB法提取恥垢分枝桿菌基因組DNA
        5.2.3 瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌基因組DNA的結合情況
        5.2.4 紫外光譜法檢測抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌基因組DNA的結合方式
    5.3 實驗結果
        5.3.1 抗菌肽D-W3R6與恥垢分枝桿菌的共定位
        5.3.2 抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌基因組DNA的結合
        5.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽與恥垢分枝桿菌基因組DNA的結合方式
    5.4 討論
結論
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況
致謝



本文編號：3707946