本文關(guān)鍵詞：NLRC5的甲基化修飾對巨噬細胞表型變化的調(diào)控作用和部分機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：巨噬細胞是先天免疫反應(yīng)中必不可少的組成成分,它來源于外周血中的單核細胞,當(dāng)單核細胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移和通過內(nèi)皮細胞外滲,進一步分化成各種組織駐留的巨噬細胞。類似于Th1/Th2細胞分化,巨噬細胞在不同的微環(huán)境下也可以分化為兩種成熟的表型,通常被稱作M1型和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞也稱之為經(jīng)典活化的巨噬細胞,可由干擾素γ(IFN-γ)或與脂多糖(LPS)共同刺激產(chǎn)生,而M2型(即選擇性活化的巨噬細胞)可由各種細胞因子誘導(dǎo),包括IL-4、IL-13和免疫復(fù)合物等。一般來說,M1型活化的巨噬細胞高表達IL-12和IL-23,低表達IL-10;代謝精氨酸,產(chǎn)生高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS),此外M1型巨噬細胞分泌大量的促炎因子如IL-1β,IL-6和TNF-α等。相反,M2型活化的巨噬細胞高表達IL-10,低表達IL-12和Il-23,并產(chǎn)生精氨酸酶。更重要的是,這兩種表型的巨噬細胞具有復(fù)雜的異質(zhì)性和功能的多樣性,其中許多特征相互矛盾:包括促炎癥活性和抗炎活性,促腫瘤活性和抗腫瘤活性,免疫原性和免疫耐受性,還有組織破壞性和組織修復(fù)性。上述的這些表型和功能變化的巨噬細胞對于很多疾病都具有重要作用,例如肝纖維化、腫瘤、肥胖癥等。靶向巨噬細胞表型變化并針對這些疾病的微環(huán)境來相應(yīng)地改變巨噬細胞的表型可能成為治療疾病的新的希望。但是目前巨噬細胞的表型變化以及潛在的機制尚未明確。NOD樣受體家族,是最近被發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)中的一個模式識別受體,已經(jīng)被證明可以調(diào)控炎癥反應(yīng)和Ⅰ類MHC轉(zhuǎn)錄。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體家族的成員之一,NLRC5(由氨基酸的CARD樣區(qū)域、中間的NOD樣區(qū)和羧基端的亮氨酸重復(fù)序列區(qū)域三部分組成)對巨噬細胞炎癥因子分泌有著負(fù)性調(diào)控的作用,也證實了NLRC5對肝纖維化的作用及可能機制(NF-κB信號通路)。根據(jù)NLRC5能夠有效抑制機體的天然免疫和炎癥反應(yīng),進一步探索NLRC5是否對巨噬細胞表型變化起到調(diào)控作用并探討潛在的機制,本研究主要分為以下幾個部分:1.建立RAW264.7細胞的M1和M2兩種表型變化模型。選用RAW264.7(小鼠腹腔巨噬細胞株)為研究對象,使用LPS(1000 ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)共同作用12 h誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化,而使用IL-4(15ng/ml)刺激細胞向M2型變化。2.NLRC5在兩種表型變化巨噬細胞中的表達。實驗研究的對象是RAW264.7細胞,分別用RTq-PCR和Western Blot法檢測NLRC5在兩種表型變化的巨噬細胞中m RNA和蛋白的表達。實驗結(jié)果可以看出,M1表型的巨噬細胞中NLRC5的表達降低,而M2中NLRC5的表達升高,重復(fù)試驗結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計分析,與正常組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.NLRC5的下游調(diào)控機制研究。實驗研究的對象是RAW264.7細胞。有文獻報道Notch信號通路在M1型巨噬細胞表型變化中起到重要的作用,本文通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染NLRC5 RNAi和p EGFP-C2-NLRC5后使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,Western Blot法檢測NLRC5沉默和過表達后Notch1以及下游蛋白Hes1的表達,結(jié)果提示NLRC5調(diào)控M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化可能是由Notch信號通路介導(dǎo)的。4.NLRC5的上游調(diào)控機制研究。以RAW264.7細胞為研究對象,RT-q PCR和Western Blot結(jié)果顯示在M1型表型變化的巨噬細胞給予甲基化抑制劑(5-azad C)可以明顯增加NLRC5的表達,并同時也可以減少M1型標(biāo)志物(i NOS、TNF-α)的表達,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;然后我們利用焦磷酸測序的方法檢測NLRC5啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài),進一步證明了NLRC5在M1型巨噬細胞中甲基化的發(fā)生;再次,我們通過小干擾RNA對甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑1(DNMT1)進行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)M1巨噬細胞中NLRC5的表達降低可能是NLRC5的高甲基化引起的。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細胞表型變化 NLRC5 DNMT1 Notch信號 RAW264.7
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 英文縮咯詞6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 1. 前言14-15
• 2. 實驗材料與實驗方法15-33
• 2.1 實驗材料15-17
• 2.1.1 實驗細胞15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 儀器與設(shè)備16-17
• 2.1.4 圖像分析軟件17
• 2.2 實驗方法17-33
• 2.2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)17
• 2.2.2 RAW264.7細胞表型變化模型的建立與鑒定17-18
• 2.2.3 實驗檢測內(nèi)容與方法18-33
• 3. 結(jié)果33-50
• 3.1 RAW264.7細胞M1和M2表型變化模型的建立與鑒定33-37
• 3.1.1 RAW264.7細胞表型變化模型的建立33-35
• 3.1.2 RAW264.7細胞表型變化模型的鑒定35-37
• 3.2 NLRC5對RAW264.7細胞M1和M2的調(diào)控作用37-43
• 3.2.1 RAW264.7細胞M1和M2模型中NLRC5mRNA和蛋白表達的變化37-38
• 3.2.2 過表達NLRC5抑制RAW264.7細胞M1表型變化38-41
• 3.2.3 沉默NLRC5促進RAW264.7細胞M1表型變化41-43
• 3.3 NLRC5通過Notch1信號調(diào)控M1表型變化43-45
• 3.3.1 Notch1在巨噬細胞表型變化過程中的表達43-44
• 3.3.2 沉默和過表達NLRC5對Notch信號通路和M1表型變化標(biāo)志物蛋白表達的影響44-45
• 3.4 NLRC5的上游調(diào)控機制45-50
• 3.4.1 NLRC5在RAW264.7細胞M1和M2中的甲基化狀態(tài)45-46
• 3.4.2 DNA甲基化抑制劑5-azadC對RAW264.7細胞的影響46-48
• 3.4.3 DNMT1調(diào)控RAW264.7細胞1表型變化48-50
• 4. 討論50-53
• 5. 結(jié)論53-54
• 參考文獻54-58
• 附錄58-60
• 致謝60-61
• 綜述61-80
• References74-80

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本文編號：365135