胰腺癌是一種高度惡性的消化系腫瘤,其臨床表現(xiàn)隱匿,發(fā)展迅速,預(yù)后極差,成為腫瘤病學的一大挑戰(zhàn)。目前胰腺癌的臨床發(fā)現(xiàn)和診斷基本上是依賴組織成像學及細胞檢測方法,難以實現(xiàn)早期診斷。在此背景下,細胞適配體因其高親和力和高選擇性等眾多優(yōu)勢而備受關(guān)注,CELL-SELEX技術(shù)也因其獨特的優(yōu)勢得到了快速的發(fā)展,為解決上述問題提供了一種新思路。本工作基于CELL-SELEX技術(shù),以人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1為靶細胞,以人肺腺癌細胞A549為對照細胞,開展能特異性識別PANC-1的核酸適配體的篩選工作。主要研究內(nèi)容包括:1.對篩選中涉及的PCR問題進行詳細的探討。本研究主要通過循環(huán)數(shù)的調(diào)整來獲得高效且特異性的PCR結(jié)果。在篩選前部分都投入大量的模板進行PCR以減少有效序列的遺失,并討論了不同的PCR情況對篩選的影響。2.對進化文庫的制備與定量問題進行詳細的研究。在進化文庫的制備中,針對雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^程進行了熒光監(jiān)控。在進化文庫的脫鹽處理上,比較了乙醇沉淀法與除鹽干燥法的優(yōu)缺點。在進化文庫的定量問題上,針對羧基熒光素FAM熒光強度對p H的敏感性,分別采用了0.2M Na OH和1×BB為背景進行定量... 

【文章來源】：蘇州大學江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

核酸適配體與靶分子結(jié)合原理示意圖

序 言 CELL-SELEX 基礎(chǔ)上 PANC-1 核酸適配體的篩選(1) 篩選所需的寡核苷酸文庫是通過化學方法合成，無需通過動物體內(nèi)，可大量快速在體外合成。(2) 靶標范圍很廣泛，小到 ATP、病毒、金屬離子[23-25]、氨基酸[26-29]等小分子，大到酶、肽以及不同大小和功能的蛋白質(zhì)[30-31,81-83]等生物大分子，也可以是完整的細胞[32-37]、切片[59]等。(3) 相對于抗體有更高的親和性和穩(wěn)定性，蛋白容易失活，在構(gòu)建生物傳感器時其物理化學性質(zhì)不穩(wěn)定，和變性的適配體很容易復(fù)性。(4) 結(jié)構(gòu)簡單，容易進行結(jié)構(gòu)的設(shè)計和修飾，如在其末端連接一些活性基團。(5) 還有分子量小、體積小、無免疫原性[90,91]、組織滲透好等優(yōu)點正是由于核酸適配體優(yōu)異的性質(zhì)，引起了研究者的廣泛關(guān)注，核酸適配相關(guān)的研究也如火如荼。如圖 2 所示，自 1990 年發(fā)現(xiàn)以來，研究者們通過修改 SELEX 方法，擴大篩選靶標范圍，SELEX 技術(shù)經(jīng)歷了里程碑式的發(fā)展。

文庫的構(gòu)建：利用 DNA 化學合成技術(shù)，構(gòu)建一個核酸適配體文庫1013~1018條不同堿基的序列，序列組成包括一個中間序列可變的隨定的恒定區(qū)。隨機序列區(qū)一般包15~60個堿基之間，兩端特定序列區(qū)間，后者在 PCR 中作為引物的結(jié)合位點。若使用 RNA 作為文庫，區(qū)加入噬菌體 T7 啟動子，以使 RNA 文庫轉(zhuǎn)化成 DNA 文庫。文庫與靶分子的結(jié)合：將隨機寡核苷酸文庫與靶細胞在合適的緩沖使靶細胞與結(jié)合能力強的序列形成“核酸-靶細胞”復(fù)合物。增加負篩選，即將篩選文庫和對照細胞孵育結(jié)合，收集未與對照細再將該上清液投入靶細胞中進行孵育。反篩選的引入有利于將非特快速淘汰。分離：通過一些合適的分離方法，如傳統(tǒng)的親和層析、硝酸纖維膜，將與靶細胞結(jié)合能力強的寡核苷酸保留，而未結(jié)合的和結(jié)合弱寡離。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]血清CA199 CA125 CA242癌胚抗原表達水平與胰腺癌的早期診斷和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性研究[J]. 馬學柱.  山西醫(yī)藥雜志. 2016(13)
[2]厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌有效性和安全性的Meta分析[J]. 謝錚錚,梁瑤,孫路路.  中國臨床藥理學雜志. 2016(08)
[3]胰腺癌MRI研究進展[J]. 徐生芳,郭順林,辛仲宏,楊梅,張艷利.  中國CT和MRI雜志. 2014(02)
[4]微小RNA與胰腺癌關(guān)系研究進展[J]. 胡應(yīng)霞,張海蓉.  醫(yī)學研究生學報. 2014(04)
[5]SELEX法體外篩選胃癌細胞適配子方法的建立[J]. 李真真,韓躍武,劉玲玲,韓亞萍,路艷,王春霞.  生物技術(shù). 2009(03)

碩士論文
[1]核酸適配體納米粒柔性支架及其循環(huán)腫瘤細胞的高效捕獲[D]. 劉玲.蘇州大學 2016
[2]應(yīng)用CELL-SELEX篩選PANC-1細胞適配體技術(shù)研究[D]. 鮑立新.蘇州大學 2015



本文編號：3523143