目的葡萄糖激酶（GK）是治療Ⅱ型糖尿病的重要靶標(biāo)。旨在通過原核表達(dá)獲得人源GK,并建立葡萄糖激酶激動(dòng)劑（GKAs）分子篩選體系,用于篩選靶向GK的抗Ⅱ型糖尿病先導(dǎo)化合物。方法采用基因重組的方法構(gòu)建GK原核重組表達(dá)載體GK-pET28a,將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中,采用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),且對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用Ni-NTA對(duì)融合蛋白進(jìn)行分離純化。通過Western-blot鑒定蛋白且通過雙酶偶聯(lián)法對(duì)蛋白酶進(jìn)行活力測試。建立葡萄糖激酶激動(dòng)劑分子篩選體系,篩選活性化合物,并通過表面等離子共振技術(shù)（SPR）和計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)探究活性化合物與葡萄糖激酶的結(jié)合情況。結(jié)果通過基因重組將葡萄糖激酶與p ET28a原核表達(dá)載體構(gòu)建成融合質(zhì)粒,并且確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為:0.5 mmol·L^-1,37℃,4～5 h。最佳純化條件為:含10 mmol·L^-1咪唑緩沖液洗雜蛋白,含100 mmol·L^-1咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。通過WesternBlot鑒定表達(dá)的蛋白為目的蛋白,且蛋白酶具有較高的活力。成功建立GKA... 

【文章來源】：中國海洋藥物. 2020,39(05)CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

GK酶活檢測原理

將GK-p ET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21(DE3）中，采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)法誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，IPTG是1種極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)表達(dá)載體中插入序列的蛋白翻譯，且不被細(xì)胞代謝而十分穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同誘導(dǎo)條件對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化（見圖3），確定了最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度37℃，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間為4～5 h。圖3 不同誘導(dǎo)條件蛋白的表達(dá)

不同誘導(dǎo)條件蛋白的表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3441651