目的:從SFRP4/Wnt/β-catenin/Fox O3a/p27通路的角度,研究熊果酸（UA）對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞增殖的抑制作用。方法:復(fù)制SD大鼠高脂血癥模型,免疫組化技術(shù)檢測(cè)其胸主動(dòng)脈壁SFRP4的蛋白表達(dá);復(fù)制AngⅡ（0.1μM）誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖模型,實(shí)驗(yàn)分組為:正常對(duì)照組,AngⅡ模型組,UA組（5μM,10μM,20μM）,UA組均預(yù)給藥12h后加入AngⅡ造模24h,CCK-8法檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性;RT-PCR和western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞SFRP4、β-catenin、Fox O3a、p27的m RNA和蛋白水平;免疫熒光技術(shù)觀測(cè)β-catenin的胞內(nèi)定位;首次應(yīng)用RNA干擾技術(shù),驗(yàn)證A7r5細(xì)胞通路級(jí)聯(lián)關(guān)系及UA的作用靶標(biāo),設(shè)計(jì)分組:AngⅡ模型組、模型+si-SFRP4組、模型+Wnt通路抑制劑XAV939（5μM,預(yù)孵育4h）組、UA組（20μM）、UA+si-SFRP4組、UA+Wnt通路激活劑Li Cl（500μM,預(yù)孵育4h）組;Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾效率和目的蛋白表達(dá);采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)... 

【文章來(lái)源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
引言
第一章 實(shí)驗(yàn)材料
    1.1 受試動(dòng)物和受試細(xì)胞
    1.2 主要試劑和材料
    1.3 主要儀器與耗材
第二章 實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 動(dòng)物模型的建立
    2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)
    2.3 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
        2.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)傳代
        2.3.2 細(xì)胞的凍存
        2.3.3 細(xì)胞的復(fù)蘇
    2.4 CCK-8 檢測(cè)技術(shù)
        2.4.1 復(fù)制AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖模型
        2.4.2 測(cè)定熊果酸對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖的影響
        2.4.3 轉(zhuǎn)染si-SFRP4對(duì)模型組和給藥組細(xì)胞活力的影響
        2.4.4 Wnt通路抑制劑XAV939和激活劑LiCl的毒性檢測(cè)
    2.5 熒光定量PCR技術(shù)
        2.5.1 RNA的提取
        2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄
        2.5.3 RTFQ-PCR
    2.6 Western Blot 技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)
        2.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取和濃度測(cè)定
        2.6.2 Western blotting具體步驟
        2.6.3 Western blot數(shù)據(jù)處理
    2.7 siRNA轉(zhuǎn)染A7r5細(xì)胞
        2.7.1 轉(zhuǎn)染效率的考察
        2.7.2 轉(zhuǎn)染后的蛋白檢測(cè)
    2.8 免疫熒光技術(shù)
    2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 免疫組化結(jié)果
    3.2 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力
        3.2.1 AngⅡ造模濃度的篩選
        3.2.2 UA有效保護(hù)濃度的篩選
        3.2.3 轉(zhuǎn)染si-SFRP4對(duì)細(xì)胞增殖率的影響
        3.2.4 Wnt通路抑制劑、激活劑的細(xì)胞毒性檢測(cè)
    3.3 UA對(duì)通路中各分子的影響
        3.3.1 UA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞內(nèi)SFRP4的mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        3.3.2 UA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞內(nèi)β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        3.3.3 UA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞內(nèi)FoxO3a的mRNA及蛋白表達(dá)的影響183.3.4 UA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞內(nèi)p27的mRNA及蛋白表達(dá)的影響
    3.4 SFRP4/wnt/β-catenin/Foxo3a/p27信號(hào)通路的驗(yàn)證
        3.4.1 Western Blot檢測(cè)siRNA-SFRP4的基因沉默效率
        3.4.2 Western Blot檢測(cè)si-SFRP4對(duì)模型組和UA組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響
        3.4.3 Wnt通路抑制劑XAV939對(duì)Foxo3a/p27的影響
        3.4.4 Wnt通路激動(dòng)劑LiCl對(duì)Foxo3a/p27的影響
    3.5 免疫熒光結(jié)果
第四章 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
致謝



本文編號(hào)：3269468