目的:將來(lái)源于戈登氏菌（Gordonia neofelifaecis）的3-甾酮-Δ¹-脫氫酶[3-ketosteroid-Delta（1）-dehydrogenase,KstD]基因通過(guò)定點(diǎn)突變并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),獲得具有活性的脫氫酶。方法:克隆戈登氏菌KstD基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建野生型重組載體p Cold I-KstD;以野生型重組載體為模板,通過(guò)反向PCR定點(diǎn)突變構(gòu)建突變體重組載體pCold I-F307A,把重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）成功構(gòu)建了表達(dá)脫氫酶KSDD的重組子菌株。結(jié)果:30℃下誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的重組酶的酶活為85 217.08 U·mg^-1,比野生型提高了2.27倍,酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示重組酶對(duì)雄烯二酮的催化效率比野生型提高了2.32倍。結(jié)論:通過(guò)定點(diǎn)突變改造野生型3-甾酮-Δ¹-脫氫酶基因,將酶活性催化中心的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?其對(duì)甾體A環(huán)C1,2脫氫反應(yīng)的活性提高。本研究驗(yàn)證了KstD基因的活性位點(diǎn),為構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化雄烯二酮的基因工程菌奠定了基... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)新藥雜志. 2020,29(18)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

目的基因Kst D片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

提取的p Cold I質(zhì)粒電泳結(jié)果

將野生型重組菌和突變重組菌分別接種于液體培養(yǎng)基中，當(dāng)A600達(dá)到0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)15 h后收集菌體，超聲破碎，利用AKTA純化目的蛋白，粗酶液經(jīng)純化后收集洗脫液中蛋白，用12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖3，重組菌菌液在55 k D處出現(xiàn)目的條帶。由此可見BL21/Kst D和BL21/F307 A誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白為55.49 k D。證明Kst D蛋白在重組大腸桿菌中能夠成功表達(dá)。3酶活檢測(cè)及比酶活的測(cè)定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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