本文關(guān)鍵詞：基于質(zhì)譜的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)解析策略研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質(zhì)糖基化修飾在生理病理過程中起著重要作用,但糖蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)分析方法仍在發(fā)展中,糖蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究成為研究重點(diǎn)。在病理發(fā)生發(fā)展過程中,位點(diǎn)特異性糖鏈結(jié)構(gòu)的變化顯著。而傳統(tǒng)的PNGase F切糖與相應(yīng)的修飾位點(diǎn)與糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù),無(wú)法將糖肽的糖基化位點(diǎn),與相應(yīng)的糖鏈聯(lián)系在一起,所以,位點(diǎn)特異性糖鏈結(jié)構(gòu)解析成為當(dāng)前糖蛋白質(zhì)組研究的重要目標(biāo)。本論文有三章構(gòu)成,第一章,首先介紹糖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀,糖基化位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)解析的重要性;其次對(duì)糖基化位點(diǎn)、糖鏈結(jié)構(gòu)獲取方法及完整糖肽結(jié)構(gòu)解析的常用策略進(jìn)行概述。第二章,介紹了基于固定化Pronase E酶切,解析位點(diǎn)特異糖鏈結(jié)構(gòu)方法的建立。文中對(duì)Pronase E溶液酶切的蛋白與酶的用量比,酶切時(shí)間,Pronase E固定化酶的材料選擇,及固定化酶的有效貯存時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè),并比較優(yōu)化了親水相互作用色譜和多孔石墨化炭黑兩種富集方法、α-氰基-4-羥基肉桂酸和2,5-二羥基苯甲酸兩種基質(zhì),對(duì)于糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定的選擇性。另外,對(duì)比了MALDI-TOF儀器和高精度Q-Exactive儀器,對(duì)于檢測(cè)糖鏈結(jié)構(gòu)或完整糖蛋白方面的差異性。最后選擇Pronase E溶液酶切,蛋白比酶1:1以上,酶切時(shí)間為48 h;Pronase E固定化酶的材料選用CNBr Beads,酶與材料質(zhì)量比1:10的比例,進(jìn)行固定化酶的合成,結(jié)合效率為40%,酶切時(shí)間為24 h。選擇多孔石墨化炭黑富集,Pronase E所得糖鏈?zhǔn)褂肈HB為基質(zhì),PNGase F所得糖鏈選用DHB+1 mM Na Cl為基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF檢測(cè)。第三章,建立完整糖肽的分析策略,實(shí)現(xiàn)對(duì)血清高豐度糖蛋白的完整糖肽的定性定量分析。以IgG為標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白,經(jīng)過Trypsin酶切及HILIC富集,獲得完整糖肽,在此基礎(chǔ)上,經(jīng)過PNGase F酶切,獲得糖基化位點(diǎn)信息,結(jié)合完整糖肽的檢測(cè)信息,借助Byonic(Proteomics Discover 2.0)和Maxquant兩個(gè)軟件,并將兩個(gè)軟件得到的數(shù)據(jù)整合,獲取完整糖肽的糖基化位點(diǎn)及糖型信息,通過位點(diǎn)特異性糖肽的峰面積,以實(shí)現(xiàn)完整糖肽定量分析。并將此方法應(yīng)用于人血清11種高豐度糖蛋白的完整糖肽的分析,實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌血清樣本的完整糖肽的定性定量鑒定。為獲取肺癌的高豐度蛋白質(zhì)糖肽組成特征,尋求可能的診斷標(biāo)志物提供了方法策略。
【關(guān)鍵詞】：糖蛋白 糖鏈結(jié)構(gòu) 固定化 Pronase E 人血清高豐度糖蛋白 完整糖肽 定性定量分析
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R917
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-13
• 1.1 糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與重要功能9
• 1.2 糖蛋白的分離與富集研究方法9-11
• 1.2.1 糖蛋白的富集策略9-10
• 1.2.2 糖鏈結(jié)構(gòu)的研究方法10
• 1.2.3 完整糖肽的分析方法10-11
• 1.3 本論文研究?jī)?nèi)容11-13
• 第二章 基于固定化PRONASE E酶與質(zhì)譜的糖鏈結(jié)構(gòu)分析方法13-31
• 2.1 前言13-14
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分14-19
• 2.2.1 儀器與試劑14-15
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-19
• 2.3 結(jié)果與討論19-30
• 2.3.1 酶切方案優(yōu)化19-20
• 2.3.2 聚糖MALDI-TOF-MS分析的基質(zhì)選擇20
• 2.3.3 糖鏈富集純化方法選擇20-22
• 2.3.4 Pronase E酶解條件優(yōu)化22-24
• 2.3.5 高精度質(zhì)譜Q-Exactive檢測(cè)結(jié)果24-28
• 2.3.6 固定化Pronase E酶的活性監(jiān)測(cè)28-30
• 2.4 結(jié)論30-31
• 第三章 血清高豐度糖蛋白的完整糖肽分析31-44
• 3.1 前言31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分32-36
• 3.2.1 儀器與試劑32
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3.3 結(jié)果和討論36-43
• 3.3.1 IgG糖蛋白36-37
• 3.3.2 血清高豐度糖蛋白37-43
• 3.4 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷51
• 在學(xué)期間發(fā)表的論文51-53
• 致謝53-55
• 綜述55-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 附錄68-91

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