發(fā)布時間：2017-04-14 15:08

  本文關鍵詞：孕激素維持下ROS抑制劑NAC對NF-κB參與的小鼠子宮內膜崩解的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子宮是一個獨特的生殖器官,在孕激素(P4)和雌激素(E2)序貫性作用下,通過孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)發(fā)揮作用,使得子宮內膜形態(tài)和功能經歷著周期性、特征性改變,包括子宮內膜的增殖,分化,在未受孕情況下的崩解及相伴的出血等現(xiàn)象,構成了完整的月經周期。而且子宮內膜組織是女性體內唯一周期性的主動“創(chuàng)傷”(子宮內膜發(fā)生崩解,蛻膜化細胞發(fā)生凋亡或者壞死),主動快速修復,不留任何疤痕的組織。孕激素撤退被認為是流產和月經發(fā)生(內膜崩解)的關鍵因素,同時也是嚙齒類動物分娩的重要原因。嚙齒類動物在分娩前,母源性血清中孕激素迅速下降導致子宮收縮,從而順利分娩。但是在人類和幾內亞豬的研究發(fā)現(xiàn),整個妊娠期直到分娩,孕激素濃度一直高位存在。但發(fā)現(xiàn)PR亞型PR-A的表達迅速升高,從而使孕激素從受體水平受到了拮抗,即功能性孕激素撤退。孕激素維持子宮內膜的蛻膜化反應,但我們在研究埋植孕激素小鼠模型中觀察到在孕激素維持作用下子宮內膜依然崩解,并發(fā)現(xiàn)氧化應激OS-NF-κB信號通路激活。誘導蛻膜化細胞模型中也同樣觀察到孕激素維持下NF-κB信號通路激活和細胞凋亡,推測孕激素維持下,存在功能性孕激素撤退并激活炎癥信號通路導致內膜崩解和細胞凋亡。目的:利用小鼠月經模型,通過ROS抑制劑干預,探討孕激素維持狀態(tài)下內膜崩解的分子機制。方法:取40只8-10周齡雌性C57BL/6J小鼠在乙醚麻醉情況下行雙側卵巢切除術,恢復一周以清除內源性激素。然后按照下列時程進行序慣激素處理:在第1-3 d的AM 9:30每只皮下注射100 ng雌二醇;在第4-6 d不給予任何處理;在第7 d,將孕酮皮埋管埋植于小鼠背部皮下,同時每只小鼠皮下注射5 ng雌二醇和50 ng孕酮;在第8、9 d的AM 9:30,繼續(xù)每只皮下注射5 ng雌二醇;在第9天的AM 11:30,在第9天的AM 11:30,小鼠雙側子宮角各注射15μl過濾除菌的花生油誘導蛻膜化,并同時詳細記錄每只小鼠花生油注射的時間。蛻膜化誘導2 d后,即小鼠在第11 d的AM 11:30(將此時間點作為孕激素維持的0 h),取20只小鼠在48 h,60 h,72 h分別給予ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC),然后分別在0 h,24 h,48 h,60 h,72 h,96 h處死小鼠,取下子宮拍照,取部分組織迅速放入液氮中冷凍,用免疫組化和westernblotting分析NF-κB在細胞核與細胞質中的表達;采用免疫共沉淀檢測NF-κB與PR的相互作用;采用試劑盒測定小鼠子宮中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性以及超氧陰離子(O2·-)的含量。剩余部分浸入4%多聚甲醛,一部分組織做蘇木精-伊紅(HE)染色,用于病理形態(tài)學的檢查;剩余部分采用免疫組化方法檢測核轉錄因子NF-κB入核情況以及孕激素受體PR的定位。結果:1血清孕激素水平的測定結果顯示,在不同時間點小鼠血清中的孕激素含量基本一致,約為40 ng/ml。2小鼠子宮外觀形態(tài)和組織學觀察從外觀形態(tài)學觀察,在0-48 h,子宮顏色為粉紅色,但隨時間增加子宮出現(xiàn)充血水腫。60-72 h時子宮顏色為深紅色,水腫加劇,可觀察到暗紅色出血點,子宮橫斷剖開后可見暗紅色內容物。在96 h,子宮顏色為暗紅色,子宮橫斷剖開后,暗紅色內容物迅速流出,與孕激素撤退后的16 h子宮形態(tài)相似。給予NAC處理后的96 h,子宮顏色較同時間點的子宮顏色淺,且充血水腫程度明顯減小。組織學觀察結果顯示,在0-48 h,子宮內膜蛻膜化程度較為充分,子宮內膜結構完好。但隨時間推移蛻膜化中心區(qū)域己經有極少數(shù)核固縮的基質細胞。60-72 h,在整個蛻膜化中心區(qū)域核固縮的基質細胞數(shù)目增加,部分區(qū)域出現(xiàn)小范圍的崩解脫落。在96 h,蛻膜化中心區(qū)域的核固縮的基質細胞明顯增加,在蛻膜化中心區(qū)域的外周區(qū)域己經觀察到明顯的崩解脫落現(xiàn)象,與孕激素撤退后的16 h相似。給予NAC處理后的96 h,在蛻膜化中心區(qū)域核固縮的基質細胞較未用NAC處理的明顯減少,崩解脫落現(xiàn)象不明顯。3小鼠子宮組織中O2·-和SOD的變化觀察發(fā)現(xiàn)小鼠子宮中O2·-的水平和SOD的活性在孕激素維持的48 h內沒有顯著性變化,但在72 h,O2·-的水平與SOD的活性顯著增高。O2·-的水平和SOD的活性作為氧化應激反應的標志物,它們的升高表明子宮內氧化應激反應在孕激素維持的72 h達到一個高水平。給予NAC處理后,在72 h,O2·-的水平較未用NAC處理的降低,而SOD的活性升高,說明NAC抑制了子宮內的氧化應激反應。4 NF-κB信號通路的激活采用免疫組化方法,觀察NF-κB p65蛋白是否入核。在0 h,p65主要在細胞質中表達,隨時間的推移,p65由細胞質進入細胞核。為了進一步證實NF-κB的激活,分別提取各組子宮組織的核蛋白和質蛋白,用western blotting來半定量核與質中p65的表達量,從而評價NF-κB的活性。核蛋白中p65的含量逐漸增加,在72 h達到最大值,而在質蛋白中,p65的表達量逐漸減少,在72 h表達量最低。5 PR與NF-κB的相互作用采用免疫組化方法,對PR蛋白進行定位。結果顯示,PR在細胞核中持續(xù)表達。為了證明PR與p65的相互關系,分別提取各時間點子宮組織蛋白,加入兔抗p65多克隆抗體對蛋白進行免疫沉淀,用抗PR抗體進行western blotting分析發(fā)現(xiàn),p65可被PR抗體沉淀,并且隨著時間的延長二者的結合量逐漸增加,在72 h達到高峰。該結果表明,在體內,PR與p65之間存在相互作用。結論:研究結果表明在孕激素維持狀態(tài)下發(fā)生的子宮內膜崩解與OS-NF-κB信號通路的激活有關。其機制可能為,在孕激素維持狀態(tài)下,子宮內膜發(fā)生氧化應激反應,進而激活NF-κB p65蛋白,p65與孕激素受體PR結合,抑制了孕激素與其受體的結合,導致孕激素功能性的撤退,從而參與孕激素維持狀態(tài)下的子宮內膜的崩解的過程。
【關鍵詞】：氧化應激 N-乙酰半胱氨酸 內膜崩解 核轉錄因子-κB 孕激素受體
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12
• 材料與方法12-23
• 結果23-26
• 附圖26-30
• 討論30-33
• 結論33
• 參考文獻33-38
• 綜述 孕激素與細胞凋亡38-50
• 參考文獻44-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關鍵詞：孕激素維持下ROS抑制劑NAC對NF-κB參與的小鼠子宮內膜崩解的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：306245