目的建立重組人腸道病毒71型（enterovirus 71,EV71）病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）疫苗原液中昆蟲細(xì)胞宿主DNA殘留的地高辛探針雜交檢測(cè)方法。方法抽提昆蟲細(xì)胞sf9基因組DNA,經(jīng)分子篩純化后作為陽(yáng)性對(duì)照品;分別以1 000～5 000 bp和100～1 000 bp的基因組DNA超聲隨機(jī)小片段為模板,制備地高辛探針,與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行雜交試驗(yàn)。同時(shí)驗(yàn)證方法的檢測(cè)范圍、靈敏度和特異性,并采用該方法對(duì)3批重組EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA殘留量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果純化后DNA樣品濃度為47. 5 ng/μL,A₂₆₀/A₂₈₀值為1. 86,可作為陽(yáng)性對(duì)照。以100～1 000 bp DNA超聲隨機(jī)小片段作為模板,探針標(biāo)記效率更高,雜交顯色更清晰。該法檢測(cè)范圍為10 pg～10 ng,靈敏度達(dá)1 pg,特異性強(qiáng)。3批重組EV71 VLPs疫苗原液中每人份劑量的宿主細(xì)胞DNA殘留均<50 pg。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立的方法特異性強(qiáng),靈敏度高,可用于重組EV71 VLPs疫苗制備過(guò)程中的原液檢定及質(zhì)量控... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物制品學(xué)雜志. 2020,33(03)

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【部分圖文】：

昆蟲細(xì)胞基因組DNA分子篩柱層析圖譜和瓊脂糖凝膠電泳圖

以未純化的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照和探針標(biāo)記模板，雜交反應(yīng)的顯色深度低，梯度不明顯，最低僅能檢測(cè)到500 pg的陽(yáng)性對(duì)照品；以純化的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照和探針標(biāo)記模板，雜交反應(yīng)的顯色清晰，梯度明顯，最低可檢測(cè)到10 pg的陽(yáng)性對(duì)照品，檢測(cè)靈敏度較高。見(jiàn)圖2。因此，選擇經(jīng)純化獲得的高純度基因組DNA樣品作為最佳陽(yáng)性對(duì)照品和探針模板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2.3 DNA超聲隨機(jī)片段大小對(duì)雜交反應(yīng)的影響

以1 000～5 000 bp的基因組DNA隨機(jī)片段作為模板標(biāo)記的探針，雜交顯色相對(duì)較淺，100 pg～1 ng范圍內(nèi)梯度不明顯，檢測(cè)靈敏度為100 pg；而以100～1 000 bp的基因組DNA隨機(jī)片段作為模板標(biāo)記的探針，顯色較清晰，梯度明顯，檢測(cè)靈敏度達(dá)1 pg，表明該探針的標(biāo)記效率更高，雜交反應(yīng)更為靈敏。見(jiàn)圖3。2.4 檢測(cè)范圍、靈敏度及特異性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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