腫瘤是當(dāng)前人類面臨的一大醫(yī)學(xué)疾病。近幾十年來(lái)表觀遺傳學(xué)圍繞基因異常表達(dá)引起的腫瘤發(fā)生,獲得了許多重要的突破,其中組蛋白翻譯后修飾(PTM)是當(dāng)前世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)。組蛋白賴氨酸殘基的第五位氨基(N~ε)常常發(fā)生不同類型的PTM包括乙�；⒘姿峄�、泛素化和甲基化等。其中,組蛋白賴氨酸的異常甲基化與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、異常增殖有著密切的聯(lián)系。組蛋白賴氨酸甲基化的修飾受到兩類具有相反功能的酶調(diào)節(jié):組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMTs)和組蛋白賴氨酸去甲基化酶(KDMs)。近年來(lái),KDMs在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著越來(lái)越重要的作用,如促進(jìn)原癌基因的表達(dá)激活,免疫系統(tǒng)失調(diào),DNA損傷修復(fù)等。因此找出有效的抑制劑是治療KDMs表達(dá)異常的癌癥的關(guān)鍵所在。迄今為止,幾種不同的高通量篩選(HTS)方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于尋找KDMs的抑制劑。但是假陰性、假陽(yáng)性和無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)酶活性是這幾種方法的主要弊端,所以迫切需要一種更加優(yōu)化的檢測(cè)KDMs活性的方法。鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足,本研究針對(duì)KDMs,利用核磁共振技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了一套新穎而特異性的檢測(cè)酶活性和篩選抑制劑的方法。首先在較復(fù)雜的環(huán)境如細(xì)胞裂解液,可以高選擇性、... 

【文章來(lái)源】：深圳大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

由含有JmjC結(jié)構(gòu)域的KDMs介導(dǎo)的組蛋白賴氨酸去甲基化反應(yīng)機(jī)制

特異性測(cè)定賴氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制劑篩選中的應(yīng)用21圖3.核磁共振波譜檢測(cè)緩沖液體系KDM4A介導(dǎo)的代謝反應(yīng)。（A）組蛋白去甲基化酶KDM4A不存在時(shí)緩沖液中的底物α-KG，（B）和產(chǎn)物SUC的HCACONMR核磁共振譜；（C、D），添加純化的KDM4A時(shí)緩沖液中的底物α-KG（C）和產(chǎn)物SUC（D）的HCACONMR核磁共振譜。每個(gè)實(shí)驗(yàn)緩沖液中都含有酸提取的組蛋白，13C標(biāo)記的α-KG（0.1mg），Ascorbicacid（1mM）和(NH4)2Fe(SO4)2（50μM）。

特異性測(cè)定賴氨酸去甲基化酶活性的方法及其在抑制劑篩選中的應(yīng)用23圖4.核磁共振波譜檢測(cè)細(xì)胞裂解液中KDM4A介導(dǎo)的代謝反應(yīng)。（A）在細(xì)胞裂解液中，產(chǎn)物SUC的常規(guī)1HNMR檢測(cè)，顯示出SUC的1H信號(hào)與來(lái)自內(nèi)源分子的背景信號(hào)重疊。（B）產(chǎn)物SUC的HCACONMR核磁共振譜，其中被13C標(biāo)記的1H-13CA-13CO已用紅色標(biāo)記出來(lái)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)緩沖液中都含有13C標(biāo)記的α-KG（0.1mg），Ascorbicacid（1mM）和(NH4)2Fe(SO4)2（50μM）。


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