研究背景:隨著醫(yī)學的發(fā)展,藥物治療已成為醫(yī)療活動中最重要的、最常見的手段,每年有數(shù)以千萬的兒童在接受藥物治療。藥物治療給患病兒童帶來福音,保護他們的健康,提高他們的生命質量;同時也帶來一些不良反應,尤其是神經系統(tǒng)方面的副作用;嚴重的神經毒性反應常常使病人面臨降低藥物劑量甚至停藥的困境,同時對病人的心理、生理、和生活質量都可能產生損害。在過去幾十年里,科學家們?yōu)榱颂骄克幬锔弊饔脤χ袠猩窠浵到y(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的毒性機制,進行了大量的研究,但是進展非常緩慢。因此,研究藥物神經毒性的作用機制,已是迫在眉睫的任務。利血平(Reserpine)在臨床上被廣泛使用于高血壓與精神分裂癥的治療;其主要藥理作用機制是通過限制特異性單胺囊泡轉運體(Monoamine vesicle transporter VMAT)阻礙神經遞質進入囊泡造成突觸末端多巴胺等神經遞質的消耗。臨床觀察和研究發(fā)現(xiàn)利血平存在導致抑郁樣和帕金森樣癥狀的副作用。已有研究表明高濃度利血平對實驗動物CNS產生影響,包括在行為上運動減緩以及相關神經遞質水平的降低;利血平可以抑制多巴胺能神經元的生長和發(fā)育,減少大鼠黑質致密部酪氨酸輕化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)細胞的數(shù)量。在CNS內,多巴胺能神經元分布于端腦、間腦、腦干和脊髓,形成四個主要的投射通路,行使不同的功能。TH作為催化兒茶酚胺生物合成的限速酶,被廣泛使用于多巴胺系統(tǒng)表達的標記物。有研究表明調節(jié)細胞增殖與分化的糖蛋白Wnt家族在多巴胺能神經元發(fā)育中會出現(xiàn)差異性表達。中腦星形膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(Midbrain astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在保護多巴胺能神經元系統(tǒng)抵御神經毒性損害中發(fā)揮著重要作用。此外,Otpa與Otpb則是與多巴胺能神經元發(fā)育相關。微小RNA5(microRNAs,miRs)是一類高度保守性、非編碼RNA,通過與內源mRNA堿基配對抑制靶基因的表達來實現(xiàn)其生物學功能。數(shù)以百計的miRs在哺乳動物的大腦中表達,并參與到各種各樣的功能中。miRs與神經退化和精神疾病的病因學和病理生理學均密切有關。miRs對CNS的正常發(fā)育和生理活動以及藥物的神經毒性均具有重要的調節(jié)作用。miRs的固有特點使其成為調控神經元應激的關鍵環(huán)節(jié)之一。不同疾病的miRs表達模式不同說明不同致病機制導致的神經元損害可以表現(xiàn)在特異性的miRs變化上。miRs幾乎在調節(jié)所有細胞過程中發(fā)揮積極作用。探索潛在的miRs靶基因,臨床應用可能會取得更大進展。miR-129存在于小鼠、人類、大鼠、斑馬魚等物種體內。miR-129是通過miR-129-1和miR-129-2這兩種基因轉錄而生成,miR-129家族由miR-129-1和miR-129-2組成;miR-129-1-3p和miR-129-2-3p兩者之間只有一個堿基差異,幾乎不可能從功能上區(qū)別,統(tǒng)稱為miR-129-3p。利用miRBase數(shù)據(jù)庫查閱不同物種miR-129的序列,發(fā)現(xiàn)miR-129在不同物種中具有高度保守性,有研究表明miR-129調控一系列與癌癥的診斷和治療以及其它生理過程密切相關的基因,由此可見mtiR-129參與調控各項重要的生理活動。已有研究證實miR-129-3p在斑馬魚胚胎的腦部大量表達。據(jù)此我們推測miR-129-3p在斑馬魚大腦神經系統(tǒng)中扮演著某種重要的角色。然而,miR-129-3p對認知功能的影響及調節(jié)機制有待進一步研究。斑馬魚體型纖細,繁殖能力很強,養(yǎng)殖成本低。更重要的是,斑馬魚基因組與人類基因組相似度達87%,這意味著在其身上做實驗所得到的結果在多數(shù)情況下也適用于人體。斑馬魚是擁有脊椎動物保守的神經系統(tǒng)構造和豐富的行為模式,幼齡斑馬魚其腦部透明、結構簡單,成為探究神經系統(tǒng)發(fā)育和藥物神經毒性發(fā)病機制的理想模型。因此本研究選擇斑馬魚作為實驗模型,探討胚胎期利血平暴露對胚胎期神經系統(tǒng)發(fā)育的影響及可能的分子機制。rcan2是一種甲狀腺激素的應答基因,也是鈣依賴磷酸酶的調控基因。rcan2在小鼠大腦內特異性高表達,此外在心肌和骨骼肌中也有分布。rcan2蛋白與唐氏綜合癥、心臟肥大癥和阿爾茲海默癥等疾病病理學相關。rcan2蛋白主要通過結合并運輸Ca2+和絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶來行使功能�；罨疶細胞核因子是它的底物,可介導一系列重要信號通路的調控,包括神經元發(fā)育。有研究表明rcan2的敲除降低了小鼠的進食量,導致小鼠體重的減輕、脂肪含量的減少和運動量的輕微減弱。經過Targetscan數(shù)據(jù)庫的比對,發(fā)現(xiàn)miR-129-3p與rcan2基因擁有潛在的結合位點,推測miR-129-3p可能調控rcan2的表達。為了明確利血平神經毒性作用,miR-129-3p對斑馬魚胚胎CNS的影響,以及與rcan2的相關性。本研究設計兩部分實驗來進行:(1)利血平在斑馬魚胚胎中的神經毒性研究;(2)miR-129-3p通過rcan2拮抗利血平誘導的斑馬魚神經毒性研究。第一部分利血平在斑馬魚胚胎中的神經毒性研究目的:通過對利血平處理后斑馬魚胚胎的研究,探究其對斑馬魚早期神經系統(tǒng)發(fā)育的毒性作用。方法:行為學監(jiān)測利血平處理后斑馬魚胚胎運動功能變化,以及利血平處理后斑馬魚胚胎對光與聲音刺激的敏感性改變;液相色譜-質譜聯(lián)用儀(Liquid chromatography-mass spectrometer LC-MS)技術檢測利血平處理后斑馬魚胚胎多巴胺能神經元相關的各神經遞質水平的變化;qRT-PCR檢測利血平處理后對斑馬魚胚胎多巴胺能神經元系統(tǒng)發(fā)育相關基因表達情況的影響;原位雜交技術檢測利血平處理后斑馬魚胚胎大腦視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量改變情況。結果:不同濃度利血平處理后斑馬魚胚胎在光照或黑暗情況下均出現(xiàn)平均游動距離顯著性降低,平均游行速度明顯減緩;利血平處理后斑馬魚胚胎對外界光或聲音刺激敏感性下降,平均游動距離降低,平均游行速度減緩,刺激出現(xiàn)時反應減弱;并且發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎中單胺類神經遞質含量水平,包括多巴胺,5-輕色胺與去甲腎上腺素,在經過利血平浸泡的斑馬魚胚胎中較對照組明顯下降,而5-羥色胺代謝產物含量沒有發(fā)生明顯變化。同時,利血平處理后的斑馬魚胚胎大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量較對照組減少。而與多巴胺能神經元系統(tǒng)發(fā)育相關的基因,包括otpa,otpb,wnt1,wnt3,wnt5和manf在利血平處理組中均表現(xiàn)表達下調。結論:利血平藥物對斑馬魚早期神經系統(tǒng)會產生神經毒性作用,對其發(fā)育和功能產生影響,包括運動功能受損、對外界刺激敏感性降低、單胺類神經遞質含量減少;斑馬魚大腦中多巴胺能神經元出現(xiàn)損傷以及相關基因表達下調。本實驗成功建立斑馬魚帕金森樣模型,為今后藥物對中樞神經毒性的研究,做出很好的嘗試,并打下良好基礎。第二部分miR-129-3p通過rcan2拮抗利血平誘導的斑馬魚神經毒性研究。目的:通過對miR-129-3p在斑馬魚體內功能的研究,探究其對斑馬魚胚胎機體和早期神經系統(tǒng)發(fā)育的調控作用,以及miR-129-3p介導的rcan2拮抗利血平的神經毒性研究。方法:qRT-PCR檢測miR-129-3p在斑馬魚胚胎和成魚體內的表達譜;顯微注射miR-129-3p類似物和morpholino以高表達和敲降斑馬魚胚胎體內miR-129-3p的表達水平;免疫熒光法檢測高表達或敲降miR-129-3p后對斑馬魚胚胎頭部細胞增殖和細胞凋亡的影響;原位雜交檢測敲降miR-129-3p后斑馬魚胚胎大腦內視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量改變情況;行為學檢測利血平處理顯微注射miR-129-3p類似物的斑馬魚胚胎運動功能變化;qRT-PCR檢測利血平處理后斑馬魚胚胎miR-129-3p表達情況;原位雜交技術檢測利血平處理顯微注射miR-129-3p類似物后斑馬魚胚胎大腦內視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量改變情況;qRT-PCR檢測高表達或敲降miR-129-3p后對rcan2表達情況的影響。結果:隨著斑馬魚胚胎的發(fā)育,miR-129-3p的表達水平隨之升高;miR-129-3p在成年斑馬魚的腦部大量表達;高濃度miR-129-3p的敲降會造成斑馬魚胚胎發(fā)育畸形,而miR-129-3p的高表達則會導致斑馬魚胚胎行為學發(fā)生變化;miR-129-3p的敲降會引起斑馬魚胚胎細胞凋亡的增加;敲降miR-129-3p的斑馬魚胚胎大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量較對照組減少,而高表達miR-129-3p可部分挽救由利血平造成的斑馬魚行為減緩以及大腦中視葉前區(qū)多巴胺能神經元數(shù)量的減少。利血平處理后導致斑馬魚胚胎miR-129-3p水平下調。此外,miR-129-3p的敲降還導致了r an2的表達水平上升,而miR-129-3p高表達則引起了rcan2表達水平的下降。結論:miR-129-3p對斑馬魚的胚胎機體和神經系統(tǒng)的發(fā)育至關重要。miR-129-3p的降低會造成斑馬魚大腦中多巴胺能神經元受損。利血平處理后斑馬魚miR-129-3p水平降低。miR-129-3p的高表達可挽救由利血平暴露引起的多巴胺能神經元系統(tǒng)發(fā)育功能損傷。rcan2是miR-129-3p調控的一種潛在的靶基因。本實驗為研究藥物神經毒性的發(fā)生機制和防治措施提供新的思路。兩部分整體結論:使用利血平藥物將導致斑馬魚大腦中多巴胺能神經元的損傷;miR-129-3p對斑馬魚的胚胎機體和神經系統(tǒng)的發(fā)育至關重要;miR-129-3p的降低會造成斑馬魚大腦中多巴胺能神經元受損;利血平導致斑馬魚胚胎miR-129-3p水平降低。高表達miR-129-3p對利血平誘導的斑馬魚胚胎神經系統(tǒng)損害具有保護作用;rcan2可能是miR-129-3p調控的一個潛在的靶基因。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

ＲＩＳＣ）的一部分，它通過與靶ｍＲＮＡ?３ＴＪＴＲ完全或不完全的互補堪合，導致靶??ｍＲＮＡ的降解或翻譯的抑制，通過表觀遺傳學調控ＤＮＡ甲基化與組蛋白修飾，??從而調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡（圖１－１）?（３０－３２）。一個??ｍｉＲ可以耙向多個ｍＲＮＡ，相反，一個ｍＲＮＡ可以被多個ｍｉＲｓ耙向。ｍｉＲｓ??幾乎在調節(jié)所有細胞過程發(fā)揮積極作用，包括分化、上皮間質轉化??（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）、增殖、凋亡、遷移和血管生成等。探??索潛在的ｍｉＲｓ祀基因，臨床應用可能會取得更大進展。ｍｉＲｓ可以對其目標基因??的表達進行微調，超過２５００個ｍｉＲｓ被標注在人類基因組中，超過６０％的人類??蛋白質基因被預測為ｍｉＲｓ的靶點。??１７??

調控各項重荽的生理活動。ｍｉＲ－１２９擁有其特定的組織特異性表達模式，主要在??生物體的腦部表達，已有研宄者證實其在斑馬魚胚胎的腦部和原腎中大量表達??（

圖５?ｍｉＲ－１２９－３ｐ高表達后斑馬魚胚胎（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）行Ｆｉｇ．５?Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｚｅｂｒａ?ｆｉｓｈ?ｅｍｂｒｙｏ（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）?ａｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｍｉＲ－１２９－３ｐ??２４ｈｆ４８ｈｆ７２ｈｆ??
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本文編號：2893192