單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種食源性病原菌,革蘭氏染色陽性,在人體內主要以胞內感染形式存在。單增李斯特菌感染后可以引起腦膜腦炎,菌血癥和敗血癥。雖然慶大霉素、卡那霉素對單增李斯特菌有抑制作用,但是抗生素的濫用會導致耐藥菌的出現,因此急需尋求新的抑菌因子。噬菌體裂解酶(Bacteriophage lysin)是噬菌體感染宿主后期表達的可以裂解細菌細胞壁的肽聚糖水解酶類。天然的李斯特菌裂解酶不僅具有較強的種屬特異性并且不易誘導細菌產生耐藥性。但是天然李斯特裂解酶的活性大多比較低,因此急需發(fā)展高效的單增李斯特菌裂解酶。本研究通過將細胞穿透肽Tat與李斯特裂解酶Ply511融合發(fā)展了一種活性增強的李斯特裂解酶Ply511-N2。100μg/mL Ply511-N2能在60 min內使單增李斯特菌活菌數降低1-3個Log值,但是不能入胞殺菌。并且酶學性質表明,Ply511-N2能在溫度為4-45℃和pH為6.0-11.0時保持良好的活性。Ply511-N2對李斯特菌有較高的特異性,對單增李斯特菌有良好的殺菌效果,對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的活性較差。Ply511-N2在250μg/mL以下時對中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)毒性較低,實驗條件下細胞保持了超過90%的活性。目前檢測李斯特菌的方法因儀器昂貴,操作復雜,無法滿足現場快速檢測的需求。本研究第二部分結合前一部分發(fā)展的裂解酶,利用生物體內ATP作為檢測靶標發(fā)展了一種新型的李斯特菌檢測方法,不僅特異性和靈敏性較高,而且簡單易操作,不需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術人員。由于Ply511-N2對單增李斯特菌具有較高的特異性,Ply511-N2檢測單增李斯特菌時有ATP升高的現象,而檢測金黃色葡萄球菌時沒有ATP升高的現象。這種檢測方法對單增李斯特菌的檢測靈敏度可以達到10~4-10~5 CFU/mL。下一步希望對這種檢測方法做更多的優(yōu)化。本研究通過細胞穿透肽Tat序列與Ply511序列融合表達發(fā)展了一個活性比親本裂解酶增強的裂解酶,并利用該嵌合裂解酶發(fā)展了一種單增李斯特菌快速檢測的新方法,為進一步探索基于噬菌體裂解酶的李斯特菌治療和快速檢測打下了基礎。
【學位單位】：武漢輕工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

重度污染食物約 20 h 后開始，李斯特菌在體內潛伏期大個體潛伏期更長[15]。在初始階段，細菌主要在絨毛頂端后期大多數出現在腸絨毛的巨噬細胞中。但是致病性李道內形成明顯的組織損傷[12]。表明單增李斯特菌不會在染。攝入后，單核細胞增生李斯特菌能夠穿過腸上皮并更深的組織[16, 17]。在腸道中，通過細胞侵入到鄰近的細障的李斯特菌被淋巴和血液攜帶到腸系膜淋巴結，脾臟特菌入侵肝臟后會被一些巨噬細胞殺死[12]。在最初感染表面的吞噬細胞即庫普弗細胞（Kupffer cell）激起細胞菌，存活的細菌繼續(xù)增殖[9]。在肝臟中細菌增殖的主要被認為是李斯特菌從腸道轉移后的第一個靶器官[10]。單歷完整的細胞內感染循環(huán)。在衰弱和免疫功能低下的患菌不受限制地增殖可能導致低水平的菌血癥[9]，將會進例如腦和妊娠子宮[20]。

單核增生李斯特菌是胞內寄生菌。目前沒有發(fā)現可以入胞殺死李斯特菌的裂解酶和抗生素，因此我們希望將一段能入胞的細胞穿透肽與現有的李斯特菌裂解酶融合表達，發(fā)展重組的噬菌體裂解酶。在本研究中我們采用了細胞穿透肽 Tat（YGRKKRRQRRR）和一段合成的細胞穿透肽（KAAILCRRLRD）與噬菌體裂解酶進行融合表達了 3 種蛋白，并測試了 3 種嵌合體殺滅胞外以及胞內菌的活性。只有重組蛋白 Ply511-N2 具有較好的殺菌活性，而且高于親本裂解酶。但是，Ply511-N2 不能入胞殺菌。由于重組裂解酶 Ply511-N2 具有更好的活性和特異性，因此我們進一步將它用于單增李斯特菌的檢測。本研究采取生物發(fā)光的原理，借助熒光素酶能與 ATP 發(fā)生反應的特性來檢測環(huán)境中存在的李斯特菌。本實驗根據細菌裂解時會釋放出大量的 ATP 這一生物特性，建立一種能快速特異檢測李斯特菌的方法（如圖 1.2 所示）。該檢測方法檢測時間短，不需要長時間的增菌培養(yǎng)，不需要昂貴的儀器設備和專業(yè)的技術人員，能夠區(qū)分活菌和死菌，有望應用于食品行業(yè)中單增李斯特菌的檢測。本研究建立的檢測方法仍然需要進一步的優(yōu)化，提高對環(huán)境中單增李斯特菌定量的準確性。

武漢輕工大學碩士專業(yè)學位論文MTT 的配置：避光條件下，用分析天平精密稱取 50 mg 的 MTT 粉末于 15mL 離心管中，加入 10 mL PBS，配置成 5 mg/mL ，PH 在 7.4-7.6 范圍內的MTT 工作液。完全溶解后，用無菌 0.22 μm 的濾膜過濾后分裝于棕色 1.5 mLEP 管中，-20℃ 保存，兩個月內有效。使用前 37℃ 水浴解凍。引物的溶解：目的基因用離心機瞬時離心，按引物說明書加入對應體積的無菌蒸餾水，配置成 10 μM 的濃度，分裝后-20℃保存，使用時可放 4℃暫時保存。2.3 重組裂解酶表達載體構建
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本文編號：2888473