發(fā)布時間：2020-10-29 16:55

　　 背景:生物工程和體外培養(yǎng)技術(shù)的進步導致了用于藥物療效/毒性測試[1]、疾病建模[2],以及心臟發(fā)育的力學研究[3-5]的心肌模型開發(fā)的迅速擴大。然而,這類技術(shù)的廣泛應(yīng)用是建立可靠的人類心肌細胞來源的基礎(chǔ)上,這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建能夠準確模擬活體組織的工程化的人類心臟結(jié)構(gòu)。為此,科學家近年來致力于開發(fā)新型工程仿生心臟組織平臺,以準確地再現(xiàn)人類心肌的結(jié)構(gòu)和功能。在心臟工程領(lǐng)域,誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)因為其來自于自身體細胞,故能夠開發(fā)基于個體的醫(yī)療策略和特定患者的疾病模型,具備廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止用于心臟建模的其他方法包括使用仙臺病毒載體[6-8],該方法消除了與將轉(zhuǎn)基因整合到宿主細胞基因組有關(guān)的翻譯問題。此外,利用等體質(zhì)粒[9-12]、microRNAs[13]和直接蛋白質(zhì)傳遞[14-18]都被證明能夠產(chǎn)生可分化為跳動的心肌細胞的ipSCs。對于在推進臨床和基礎(chǔ)科學研究中使用iPSC線的熱情,人們對這些細胞是否與ESCs相同表示了關(guān)注。一方面,有人認為iPSCs和ESCs幾乎相同,因為這兩種細胞在體外表現(xiàn)出相似的表型、依賴性和行為[19-23]。此外,對大量克隆進行的分析表明,iPSC和ESC源在細胞特性方面存在相當大的重疊,因此,如果不進行深入測試,很難區(qū)分它們[24-28]。另一方面,微陣列研究表明,數(shù)百個基因以及DNA甲基化模式在iPSCs和ESCs之間存在差異表達[28-32]�？傮w而言,對iPSC和ESC系一系列特性的測量,包括基因表達、DNA甲基化、微RNA表達、分化傾向和胚胎中的互補活性,表明它們的特性確實不同[32-38]。雖然iPSC和ESC細胞之間存在著特定的差異,但是很少有確鑿的證據(jù)表明,從這些細胞來源產(chǎn)生的心肌細胞一旦分化就會有任何有意義的區(qū)別。因此,盡管未分化干細胞來源有明顯不同,iPSCs和ESC衍生心肌細胞之間具有高度的可比性,而且通常采用的心臟分化方法的重復(fù)性,再加上iPSCs在疾病建模和個性化醫(yī)學應(yīng)用方面的優(yōu)勢,使得iPSCs在臨床和基礎(chǔ)心臟研究應(yīng)用中都具有廣闊的應(yīng)用前景。目的:建立適合于藥物心臟毒性評價的人誘導多能干細胞分化的心肌細胞(hiPSC-CM)模型,并采用此模型評價化合物潛在的心臟毒性。方法:研究選用不同種類的心臟毒性藥物:蒽環(huán)類抗癌藥阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10 μ mol·L-1)、Ⅲ類抗心律失常藥物胺碘酮(10 nmol·L-1、100nmol.L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1)、鈣離子通道阻滯劑維拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1),分別與hiPSC-CM孵育,采用實時細胞分析法實時監(jiān)測心肌細胞搏動的頻率、振幅、細胞指數(shù)、場電位時程等指標在給藥前后的變化,建立人誘導多能干細胞分化的心肌細胞體外心臟毒性評價模型。結(jié)果:1.心肌細胞的純度鑒定為了驗證誘導多能干細胞源性心肌細胞實時細胞評價系統(tǒng)的精確性,采用流式細胞術(shù)的方法進行檢測心肌細胞特征性蛋白肌鈣蛋白(cardiac troponin T,cTnT)從而證明心肌細胞純度達99%。形態(tài)學純度鑒定指出分化的心肌細胞中肌鈣蛋白含量較高。2.胺碘酮對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響為了驗證胺碘酮對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響,我們檢測了 hiPSC-CM的收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場電位時程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動穩(wěn)定后,給予不動濃度的胺碘酮(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1、30 nmol·L-1三個濃度對心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場電位時程均不產(chǎn)生統(tǒng)計學意義的影響;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮給藥后,顯示出對hiPSC-CM收縮力、收縮頻率的完全抑制;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮給藥后48h開始顯示出統(tǒng)計學差異的細胞數(shù)量減低作用,顯示出細胞脫落增多,且10 μmol·L-1組細胞減少數(shù)量比1μmol·L-1組稍多,但并無統(tǒng)計學差異;10μmol·L-1的胺碘酮給藥后12h,顯示出對hiPSC-CM自主則的完全抑制;而1μmol·L-1濃度處理組大部分自主完全抑制,尚有少數(shù)仍有搏動。3.維拉帕米對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響為了驗證維拉帕米對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響,我們檢測了 hiPSC-CM的搏動狀態(tài)、收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場電位時程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動穩(wěn)定后,給予不動濃度的維拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1、10 μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1兩個濃度對心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場電位時程均不產(chǎn)生統(tǒng)計學意義的影響;隨著濃度的升高表現(xiàn)出對hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。4.阿霉素對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響為了驗證阿霉素對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響,我們檢測了 hiPSC-CM的搏動狀態(tài)、收縮力、收縮頻率、增殖曲線和場電位時程(FPDc)。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動穩(wěn)定后,給予不動濃度的阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,結(jié)果顯示,10nmol·L-1、100nmol·L-1兩個濃度對心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線、場電位時程均不產(chǎn)生統(tǒng)計學意義的影響;隨著濃度的升高表現(xiàn)出對hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。5.PM2.5對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響為了驗證PM2.5對hiPSC-CM相關(guān)指標的影響,我們檢測了 hiPSC-CM的收縮力、收縮頻率和增殖曲線。結(jié)果顯示:hiPSC-CM搏動穩(wěn)定后,給予不動濃度的PM2.5(10μg/ml、100μg/ml、100Oμg/ml)后,結(jié)果顯示,10μg/ml、100μg/ml兩個濃度對心肌收縮力、收縮頻率、增殖曲線均不產(chǎn)生統(tǒng)計學意義的影響;隨著濃度的升高為1000 μg/ml時表現(xiàn)出對hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。結(jié)論:利用人誘導多能干細胞分化的心肌細胞可以建立一種可行的體外心臟毒性評價模型,結(jié)合實時細胞分析法可快速、靈敏、準確的評價藥物的心臟毒性
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖１．胺碘酮對ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收縮力（幅度）的影響??表１．胺碘酮對ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收縮力（幅度）的影響＊Ｐ＜０．０５??￣￣?給藥前￣給藥后￣給藥后?給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后￣給藥后?給藥后??７７?ｚＨ??１２ｈ?２４ｈ?３６ｈ?４８ｈ?６０ｈ?７２ｈ?７６ｈ?８０ｈ?８４?ｈ?９０ｈ?９６ｈ??０?ｌ°．ＤＭＳＯ?１００１０００?１０５±?００８?１．０４土０?０４?１０５土００６?１０５±００４?１．０７±０?０４?１．１１±０?０６?１．０６ｉ０?０６?１．１３±０１０?１０５±０．０８?１．１６±００８?１〇７±〇１〇??１０?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?１．００＊０?００?０．９９±００５?０．９９±０１４?］?０６±０?０６?１０９±０１４?１．０５±０．１３?０．９２±０１０?０．８９＊０?０８?１．００±００６?１０１?±０．０８?０．９８±００８?０．８８±０．０７??ｌＯＯｉｉｍｏｌＬ－１?１００?士０．００?０．９９±?０?０５?１．２１±０１２?１２４＊０１４?１０９±０１３?ｌ．］７±〇１５?１．１０±０１１?１．１０＊０．０９?１．０２＊０．０７?０．９４?±０．０７?１．００±００５?０９８±００５??３００?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?ｌ．ＯＯｉＯ?ＯＯ?１．０５±０１２?１．２５±０１７?１１３±０１８?１０２±０１３?０．９４±０?０９?０．９８＊０．１３?１．００±０１２?１．１１±０１１?１０７±０．２０?１．０９±０?０６?１．０３±０．〇７??１?晴ｊＬ．ｌ?１．００１０．００?０．１６±０．１６?０，４４?±０．２８?０．０７±０

予不同濃度的胺碘酮（１０?ｎｍｏｌ．Ｌ＿ｌ、１００?ｎｍｏｌ．Ｉ／１、３００?ｎｍ〇ｒＬ＿ｌ、ｌｐｍｏｒｉ／１、??１０?ｐｍｏｌ?Ｌ—１?；）后，收縮力隨時間變化的曲線圖見圖２和表２。結(jié)果顯示，與對收??１９??

予不同濃度的胺碘酮（１０?ｎｍｏｌ．Ｌ－１、１００?ｎｍｏｌ．Ｉ／１、３００?ｎｍｏｌ．Ｌ＇?ｌ｜ｉｍｏｌ．Ｌ＿１、１０??ｐｍｏｌ．Ｌ－１）后，增殖曲線隨時間變化的曲線圖見圖３和表３，?ｌｐｍｏｌ．Ｌ＇ｌＯ＾ｍｏｌ．Ｉ；１??的胺碘酮給藥后４８ｈ開始顯示出統(tǒng)計學差異的細胞數(shù)量減低作用，顯示出細胞??脫落增多，且ｌＯｐｍｏｌ?Ｌ／１組細胞減少數(shù)量比ｌｐｍｏｌ?Ｌ／１組稍多，但并無統(tǒng)計學差??異。１０?ｎｍｏｌ?Ｌ—１、１００?ｎｍｏｌ?Ｌ＇１、３００?ｎｍｏｌ?Ｕ１組別對增殖曲線不產(chǎn)生統(tǒng)計學意義??的影響。??２．０?ｎ??０．１％ＤＭＳＯ??１０?ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??１?５－?ｌＯＯｎｍｏｌ－?Ｌ－１??３００ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??ｃＳ?１｜ｊｍｏｌ－?Ｌ－１??Ｊ?１。＿?Ｍ??０．５－??０?１２?２４?３６?４８?６０?７２?８４?９６??ｔｉｍｅ（ｈ）??圖３．胺碘酮對ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲線的影響??表３胺碘酮對ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲線的影響＊Ｐ＜０．〇５??２１??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王廣鶴;甄玲燕;呂鵬;蔣蓉芳;宋偉民;;臭氧和細顆粒物暴露對大鼠心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)和系統(tǒng)炎癥的影響[J];衛(wèi)生研究;2013年04期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 段軍;可吸入顆粒物對大鼠心臟交感神經(jīng)分布和神經(jīng)生長因子表達的影響及β受體阻滯劑的干預(yù)作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

本文編號：2861189